上海MTT检测实验

一、实验原理

1. 酶促反应
   活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT（噻唑蓝）还原为蓝紫色水不溶性的甲瓒结晶（Formazan），而死细胞无此功能。
2. 检测方法
   通过二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒后，用酶标仪在490/570nm波长下测量吸光度（OD值），OD值与活细胞数量正相关。

二、实验步骤（以贴壁细胞为例）

1. 细胞接种

   • 调整细胞悬液浓度至5×10⁴~1×10⁵个/mL，每孔接种100μL（96孔板）。
   • 37℃、5% CO₂培养16-48小时，待细胞贴壁。

2. 药物处理

   • 加入不同浓度药物，继续培养24-72小时（根据实验目的调整时间）。

3. MTT孵育

   • 每孔加入20μL MTT溶液（终浓度0.5 mg/mL），避光培养4小时。

4. 溶解与检测

   • 弃去培养液，每孔加150μL DMSO，振荡溶解甲瓒结晶。
   • 用酶标仪测定490/570nm处的吸光度，计算细胞增殖率或存活率。

三、注意事项

1. 关键操作要点

   • 空白对照：设置不含细胞的孔（含培养基和MTT）以校准背景值。
   • 细胞密度：贴壁细胞建议密度为1×10⁴~1×10⁵个/孔，过高或过低均影响准确性。
   • 避光保存：MTT溶液需现用现配或分装避光保存（4℃两周内有效，-20℃长期保存）。

2. 局限性

   • 需溶解甲瓒结晶，步骤繁琐且有机溶剂对实验者有害。
   • 仅反映细胞相对数量和活力，无法测绝对数量。