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- 2026年01月08日
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上海达为科生物科技有限公司
- 服务名称：
细胞原位杂交实验
一、定义与原理
细胞原位杂交（In Situ Hybridization, ISH）是一种在细胞或组织原位检测特定核酸序列的技术。其核心原理基于碱基互补配对原则，利用标记的核酸探针与靶DNA或RNA序列特异性结合，通过检测标记物实现基因表达的时空定位。
- 探针类型：包括DNA探针、RNA探针（cRNA）、寡核苷酸探针，标记方式分为放射性（如³H、³²P）和非放射性（荧光、酶联、地gao辛）。
- 技术分类：根据靶标类型分为DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交；根据检测方式分为直接法（探针直接标记）和间接法（半抗原标记后通过抗体检测）。
二、操作步骤与关键试剂
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样本制备
- 固定：常用4%多ju甲醛或甲醇/bing酮混合液，维持细胞形态并防止核酸降解。
- 包埋与切片：石蜡包埋需梯度脱水后浸蜡，冰冻切片需液氮速冻；细胞爬片需固定后密封运输。
- 预处理：蛋白酶K消化增加通透性，阻断内源性过氧化物酶（3%甲醇-H₂O₂）。
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探针制备与标记
- 探针设计需考虑特异性（避免非靶结合）、长度（100-500 bp为佳）及稳定性。
- 标记方法：荧光（FITC、CY3）、酶联（地gao辛-碱性磷酸酶）、同位素（需放射自显影）。
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杂交与检测
- 杂交条件：温度通常低于解链温度（Tm）25℃，时间过夜（16-24小时）。
- 洗涤：梯度SSC缓冲液（2×至0.5×）去除未结合探针。
- 信号检测：荧光显微镜（直接观察荧光标记）、酶联显色（如NBT/BCIP显蓝色沉淀）、放射自显影。
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关键试剂
- 固定剂：多ju甲醛、甲醇/bing酮。
- 缓冲液：DEPC水（防止RNA酶污染）、SSC（调节离子强度）、甲酰胺（降低杂交温度）。
- 封闭剂：BSA、鲑鱼精DNA（减少非特异性结合）。
三、应用领域
- 基因表达分析：定位mRNA时空分布，研究发育生物学中的基因调控网络。
- 疾病诊断：
- 病毒检测：如HPV、EB病毒、肝炎病毒的核酸定位。
- 肿瘤研究：癌基因（如HER2）、抑癌基因表达分析及染色体异常（如Burkitt淋巴瘤的染色体易位）。
- 细胞遗传学：染色体数目异常（非整倍体）、结构变异（易位、缺失）的检测。
- 神经科学：神经元特异性RNA（如神经递质合成酶）的亚细胞定位。
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文献和实验一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1．取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol／LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ／tube)，-80℃保存。 2．转化
原位杂交组织（或细胞）化学 （In situ Hybridization Histochemistry，ISHH） 简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标
1. 实验目的 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。 2. 实验原理 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛
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