上海细胞原位杂交实验

一、定义与原理

细胞原位杂交（In Situ Hybridization, ISH）是一种在细胞或组织原位检测特定核酸序列的技术。其核心原理基于碱基互补配对原则，利用标记的核酸探针与靶DNA或RNA序列特异性结合，通过检测标记物实现基因表达的时空定位。

• 探针类型：包括DNA探针、RNA探针（cRNA）、寡核苷酸探针，标记方式分为放射性（如³H、³²P）和非放射性（荧光、酶联、地gao辛）。
• 技术分类：根据靶标类型分为DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交；根据检测方式分为直接法（探针直接标记）和间接法（半抗原标记后通过抗体检测）。

二、操作步骤与关键试剂

1. 样本制备

   • 固定：常用4%多ju甲醛或甲醇/bing酮混合液，维持细胞形态并防止核酸降解。
   • 包埋与切片：石蜡包埋需梯度脱水后浸蜡，冰冻切片需液氮速冻；细胞爬片需固定后密封运输。
   • 预处理：蛋白酶K消化增加通透性，阻断内源性过氧化物酶（3%甲醇-H₂O₂）。

2. 探针制备与标记

   • 探针设计需考虑特异性（避免非靶结合）、长度（100-500 bp为佳）及稳定性。
   • 标记方法：荧光（FITC、CY3）、酶联（地gao辛-碱性磷酸酶）、同位素（需放射自显影）。

3. 杂交与检测

   • 杂交条件：温度通常低于解链温度（Tm）25℃，时间过夜（16-24小时）。
   • 洗涤：梯度SSC缓冲液（2×至0.5×）去除未结合探针。
   • 信号检测：荧光显微镜（直接观察荧光标记）、酶联显色（如NBT/BCIP显蓝色沉淀）、放射自显影。

4. 关键试剂

   • 固定剂：多ju甲醛、甲醇/bing酮。
   • 缓冲液：DEPC水（防止RNA酶污染）、SSC（调节离子强度）、甲酰胺（降低杂交温度）。
   • 封闭剂：BSA、鲑鱼精DNA（减少非特异性结合）。

三、应用领域

1. 基因表达分析：定位mRNA时空分布，研究发育生物学中的基因调控网络。
2. 疾病诊断：
   • 病毒检测：如HPV、EB病毒、肝炎病毒的核酸定位。
   • 肿瘤研究：癌基因（如HER2）、抑癌基因表达分析及染色体异常（如Burkitt淋巴瘤的染色体易位）。
3. 细胞遗传学：染色体数目异常（非整倍体）、结构变异（易位、缺失）的检测。
4. 神经科学：神经元特异性RNA（如神经递质合成酶）的亚细胞定位。