MTT实验

专业承接各类裸鼠、大鼠、小鼠、兔等动物模型建立以及后续检测服务，模型建立包含裸鼠皮下瘤、原位瘤、糖尿病模型、胃炎模型、急性肺损伤、肺纤维化、子宫内膜异位、白癜风、痛风、骨缺损、肝纤维化、关节炎、脓毒症、支气管哮喘、抑郁症、白血病、脑缺血再灌注、骨质疏松、酒精性肝病、学习记忆障碍、胃溃疡、急性心肌缺血、感染性休克、肝硬化等动物实验模型建立，以及后续各项检测。

  在生命科学研究领域内，进行实验研究所需要的基本条件可以总括为：实验动物、设备、信息和试剂。实验动物作为生命科学研究中的基本要素之一，在很多领域的科学研究中，充当着非常重要的安全试验、效果试验、标准试验的角色，尤其在药物有效性和安全性评价中发挥着不可或缺的作用。

  安徽乐奥贝生物技术公司可以独立开展包括大鼠、小鼠、裸鼠、豚鼠、兔等常见实验动物在内的动物造模及相关实验，现已熟练掌握近30余种不同类型动物模型的造模方法。

1. 实验原理
   • MTT（3 - (4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基) - 2,5 - 二苯基四氮唑溴盐）实验是一种检测细胞活力和增殖的常用方法。其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），而死细胞则无此功能。甲臜的生成量与活细胞的数量和功能状态呈正相关。可以用 DMSO（二甲基亚砜）等有机溶剂溶解甲臜后，通过酶标仪检测其在特定波长（一般为 570nm 左右）下的吸光度值（OD 值），从而间接反映细胞活力。
2. 实验准备
   • 细胞培养
     • 选择合适的细胞系，例如研究肿瘤细胞对药物的敏感性时，常用的肿瘤细胞系有 A530（人肺癌细胞）、MCF - 7（人乳腺癌细胞）等。细胞需要在适宜的培养基中培养，如 DMEM（含 10% 胎牛血清）、RPMI - 1640（含 10% 胎牛血清）等，在 37℃、5% CO₂的环境下培养至对数生长期，因为此时细胞的活力和增殖能力较强，适合用于 MTT 实验。
   • 试剂准备
     • MTT 溶液：一般用 PBS（磷酸盐缓冲液）将 MTT 配制成 5mg/mL 的储备液，过滤除菌后，在 - 20℃下避光保存。使用时用无血清培养基稀释至所需浓度，如 0.5mg/mL。
     • DMSO 溶液：用于溶解甲臜，要求纯度较高，分析纯以上级别即可。
     • 药物或处理因素：如果是研究药物对细胞的影响，需要准备好相应的药物，用合适的溶剂（如 PBS 或培养基）溶解，并配制成不同浓度的溶液。
3. 实验步骤
   • 细胞接种
     • 将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液。按照一定的细胞密度接种到 96 - 孔板中，每孔的细胞数量根据细胞类型和实验目的而定，一般在 1×10³ - 1×10⁵个细胞 / 孔之间。例如，对于生长速度较快的细胞，接种密度可以稍低，如 5×10³ 个细胞 / 孔；对于生长较慢的细胞，接种密度可以适当提高。接种后，将 96 - 孔板放入 37℃、5% CO₂培养箱中培养一段时间，让细胞贴壁，一般需要 2 - 4 小时。
   • 药物处理或干预
     • 根据实验设计，对细胞进行药物处理或其他干预。如果是研究药物的细胞毒性，将配制好的不同浓度的药物溶液加入到孔板中的细胞中，每个浓度一般设置 3 - 6 个复孔。药物作用时间根据药物的性质和实验目的而定，短则数小时，长则数天，例如，研究化疗药物对肿瘤细胞的急性毒性作用，作用时间可以是 24 - 48 小时。
   • MTT 添加与孵育
     • 药物处理结束后，每孔加入 MTT 溶液，使终浓度为 0.5mg/mL 左右，然后将 96 - 孔板放入 37℃、5% CO₂培养箱中继续孵育 3 - 4 小时。在此期间，活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶会使 MTT 还原为甲臜。
   • 甲臜溶解与检测
     • 孵育结束后，小心吸出孔内的上清液，注意不要吸出甲臜结晶。然后每孔加入 DMSO 溶液 150 - 200μL，在摇床上低速振荡 10 - 15 分钟，使甲臜充分溶解。溶解后，用酶标仪在 570nm 波长（参考波长可以选择 630nm 或 690nm）下检测各孔的吸光度值（OD 值）。
4. 实验结果分析与注意事项
   • 结果分析
     • 根据检测得到的 OD 值计算细胞活力。通常以未处理组（对照）的 OD 值为 100%，计算药物处理组的细胞活力百分比，计算公式为：细胞活力（%）=(药物处理组 OD 值 / 对照组 OD 值)×100%。通过绘制药物浓度 - 细胞活力曲线，可以直观地观察药物对细胞活力的影响，评估药物的细胞毒性或细胞增殖促进作用等。
   • 注意事项
     • MTT 溶液有一定的毒性，操作时要注意防护。
     • 加入 MTT 溶液后，细胞要在适宜的条件下充分孵育，确保 MTT 被活细胞充分还原为甲臜。
     • 溶解甲臜时，DMSO 的加入量要足够，并且要充分振荡，使甲臜完全溶解，否则会影响检测结果的准确性。