细胞周期实验

一、实验原理与生物学意义

1. 细胞周期定义

   • 指细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束的全过程，包含 间期（G1/S/G2） 和 分裂期（M） 。
   • G0期：暂不增殖的休眠状态（如干细胞或分化细胞）。

2. 检测核心目标

   • 量化各时期细胞比例（G0/G1, S, G2/M）
   • 计算细胞周期时长（如S期DNA复制时长）
   • 分析药物/基因扰动对周期进程的影响 

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二、主流检测方法对比与选择

方法	原理	优势	局限	适用场景	来源
流式细胞术（PI染色）	PI结合DNA双链，荧光强度∝DNA含量	高通量（单次10⁴细胞）、快速	无法区分G0/G1期	基础药物筛选、周期比例分析
BrdU/EdU渗入法	核苷类似物标记S期DNA，抗体/荧光检测	特异性标记复制期细胞	需额外染色步骤	S期时长计算、复制动力学
FUCCI荧光报告系统	荧光蛋白标记周期蛋白（Cdt1-G1红, Geminin-S/G2绿）	实时活细胞追踪周期进程	需转基因构建	动态周期调控机制研究
同位素标记法	³H-胸苷掺入DNA，放射自显影	金标准、高灵敏度	放射性危害、操作复杂	传统方法验证

选择建议：

• 常规比例分析 → PI流式法（经济高效）
• S期动态追踪 → BrdU/EdU双标记法 
• 活细胞成像 → FUCCI系统

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三、标准化操作流程（以流式PI法为例）

1. 实验准备

• 细胞要求：
  • 对数生长期细胞（活力＞90%）
  • 样本量：≥1×10⁶细胞/组（避免碎片干扰）
• 关键试剂：
  • PI染色液（含RNase A，终浓度50μg/mL）
  • 70%预冷乙醇（固定剂）

2. 操作步骤

1. **细胞收集**：  
   - 胰酶消化 → PBS轻柔洗涤2次（1200rpm, 5min）  
   *注意：避免机械损伤产生碎片*  
2. **固定**：  
   - 逐滴加入70%冷乙醇（-20℃预冷），4℃固定≥2h   
3. **染色**：  
   - 离心弃乙醇 → PBS洗1次 → 加PI/RNase混合液（避光孵育30min, RT）  
4. **上机检测**：  
   - 300目滤网过滤 → 流式细胞仪检测（激发488nm，发射610nm）  
   *关键参数*：  
   - 流速：低速（≤100事件/秒）→ 降低CV值   
   - 排除粘连体：设门FSC-A vs FSC-H