细胞免疫荧光技术服务

一、定义与基本原理

细胞免疫荧光技术（Immunofluorescence, IF）是一种结合免疫学、生物化学和显微镜技术的可视化检测方法，通过荧光素标记的抗体与靶标抗原特异性结合，实现对细胞内或组织内抗原的定位、定性和定量分析。其核心原理基于抗原-抗体的特异性结合与荧光信号的放大机制：

• 抗原-抗体反应：抗体通过高亲和力识别并结合抗原表位，确保检测的特异性。
• 荧光标记：通过化学偶联将荧光染料（如FITC、TRITC、Alexa Fluor系列）标记在抗体上，利用荧光显微镜激发特定波长光，使目标抗原在微观尺度上可视化。
• 方法分类：
  • 直接法：荧光素直接标记一抗，操作简单但灵敏度较低，适用于高丰度抗原检测。
  • 间接法：使用未标记的一抗结合抗原后，再通过荧光标记的二抗放大信号，灵敏度更高，是实验室常用方法。

二、实验操作流程（以间接法为例）

1. 样品制备：

   • 细胞培养：将细胞接种于盖玻片或培养皿中，密度控制在（1-5）×10⁵/孔（六孔板），避免过密导致非特异性染色。
   • 固定：常用4%多ju甲醛室温固定20分钟，或甲醇/bing酮低温固定，以保持抗原表位和细胞结构。
   • 通透化：针对胞内抗原，使用0.1% Triton X-100或TX-100处理1-2分钟，增加膜通透性。

2. 封闭与抗体孵育：

   • 封闭：用5% BSA或同源血清封闭30分钟，减少非特异性结合。
   • 一抗孵育：滴加稀释的一抗（常用稀释比1:50-1:200），4℃过夜或室温孵育1-2小时，确保充分结合。
   • 二抗孵育：避光条件下加入荧光标记的二抗（如Alexa Fluor 488/594），室温孵育1小时。

3. 染色与观察：

   • 核复染：用DAPI（0.1-1 μg/mL）染色5-10分钟，标记细胞核。
   • 封片：使用抗荧光淬灭封片剂（如ProLong Gold），避免气泡产生。
   • 成像：使用荧光显微镜或共聚焦显微镜采集图像，注意及时拍摄（1小时内）以防荧光衰减。

三、主要应用领域

1. 基础研究：

   • 亚细胞定位：分析蛋白质在细胞膜、细胞质或细胞核的分布，如微管骨架的动态变化。
   • 信号通路研究：追踪激酶、转录因子的激活与转位，如NF-κB的核易位。
   • 病原体检测：定位病毒抗原（如流感病毒、RSV）在宿主细胞内的复制位点。

2. 临床医学：

   • 肿瘤诊断：检测HER2、EGFR等肿瘤标志物的表达水平与定位，指导靶向治疗。
   • 自身免疫病：通过抗核抗体（ANA）检测辅助诊断系统性红斑狼疮。
   • 感染性疾病：快速鉴定病原体（如HPV、结核分枝gan菌）。

3. 药物研发：

   • 药物靶点验证：观察药物分子与靶蛋白的共定位，评估结合效率。
   • 毒性评估：检测药物处理后的细胞凋亡标志物（如cleaved caspase-3）。