单细胞ATAC测序 （单细胞ATAC-Seq)

技术简介   伯豪生物单细胞ATAC测序

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单细胞 ATAC 测序（Aaasay for transposase Accessible Chromatin with high throughput sequencing at the single cell level）翻译成中文是在单细胞水平上通过高通量测序技术来研究染色质开放程度（也叫染色质的可及性）。染色质开放程度（染色质的可及性），反映了染色质的转录活性状态，是研究基因表达调控的重要方向，在表观遗传图谱绘制、细胞分化和发育及各类疾病的发生发展研究中具有重要的作用。

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技术原理   伯豪生物单细胞ATAC测序

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2018 年 10 月，10X Genomics 推出的 Chromium 单细胞 ATAC 解决方案提供了一种全面的、可扩展的方法来研究分析单个样本中成百上千个细胞中染色质的开放情况。通过转座酶对混合的细胞核悬液进行核 DNA 的切割，然后使用微流控芯片将溶液中的细胞核包裹到油滴中，形成纳米级的凝胶珠状乳状液（GEMs）。采用 10X 条形码，对每个细胞核切割的 DNA 加上唯一的条形码。通过文库构建，测序，最终根据 10X 条形码将测序得到的序列关联到每个单独的细胞核上。
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实验流程   伯豪生物单细胞ATAC测序

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1、转座酶切割核 DNA   伯豪生物单细胞ATAC测序
细胞核悬浮液在包括转座酶的混合液中孵育。转座酶进入细胞核，优先在染色质的开放区域将 DNA 片段化。同时，将测序接头序列添加到片段化的 DNA 片段的末端。

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2、GEM 生成及 Barcode 添加   伯豪生物单细胞ATAC测序
在 Chromium Next GEM Chip H 芯片上，使包含有 barcode 的凝胶珠，转座酶切割后的细胞核，混合液（包括 ATAC buffer 和 ATAC 酶），以及油滴进行混合，最终生成 GEMs。为了达到每个油滴中包含有单个细胞核，需要对细胞核进行有限稀释，保证生成的大多数 GEMs(~90-99%) 不包含细胞核，而其余的为包含单个细胞核 GEMs。

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GEMs 生成后，凝胶珠会溶解释放出含有（i) Illumina P5 序列、(ii) 16nt 10X 条形码序列和（iii) Read 1 (Read 1N) 序列的寡核苷酸。这些核苷酸序列会于片段化的 DNA，以及混合液进行混合。后续经过热循环后生成含有 10X barcode 的单链 DNA。经过孵育后，对 GEMs 进行破油处理，所有 GEMs 中的含有 10X barcode 的单链 DNA 混合在一起，并进行回收。

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3、破油后的纯化   伯豪生物单细胞ATAC测序
使用硅烷磁珠清除破油反应混合物中残留的生化试剂。固相可逆固定（SPRI) 珠子用于从样本中消除未使用的 10X 条形码。

4、测序文库的构建及质检   伯豪生物单细胞ATAC测序
通过 PCR 将 P7 接头以及样本的标签（Index N）添加到文库的两端，最终形成包含有 P5 和 P7 接头序列的文库，用于 Illumina 桥式 PCR 扩增。

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文库结构   伯豪生物单细胞ATAC测序

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通过 Agilent TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape 对文库进行质检，结果示例如下：

或者用  Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 来检测片段大小，结果示例如下：

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指标	参数
测序深度	每个细胞核测 25000 read pairs
测序类型	PE150，dual-index（双 index 测序）

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• 流程精简时效快： 可检测单细胞转录调控区域中的开放性染色质。
• 通量高： 每个通道 500-10000 个细胞核。
• 效率高： 细胞核捕获率高达 65%。
• 适用范围广： 经验证适用于原代细胞，冻存细胞，新鲜组织等。
• 信息分析： 获取信息量大，可精细化分析。
• 同一份样本可实现单细胞 ATAC、mRNA、TCR/BCR 同时测序，并整合数据。

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• 类型： 新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
• 来源： 血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
• 样本量及其它质控要求：

样本类型	样本质控要求
细胞悬液	>1x105  个细胞；
	活率 >80%；
	浓度 500～1,000 个细胞 /ul；
	细胞间无粘连（成团率 <5%）；
	无大于 40um 的细胞碎片或其他颗粒物；
	不存在逆转录抑制剂和非细胞的核酸分子。
血液	EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。
组织	0.3cm×0.3cm（不超过 0.5cm×0.5cm）的新鲜组织，4~5 块。

• 样本的保存与运输   伯豪生物单细胞ATAC测序

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• 细胞悬液：最好现场制备，如要运输，建议使用伯豪生物自主研发的单细胞保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。
• 血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 运输，2 小时内送达伯豪生物实验室；或提取 PBMC 后冻存，干冰运输。
• 组织：建议使用伯豪生物自主研发的单细胞 ATAC-seq 组织保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。

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• 干细胞 / 发育生物学
• 肿瘤学
• 免疫学
• 神经科学

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