伯豪生物华大时空转录组 FF 样本 V1.3 产品服务解决方案，是同时以纳米级分辨率和厘米级全景视场实现“组织到数据”的 整体解决方案，适用于新鲜冷冻（FreshFrozen，FF) 样本。为帮助研究人员利用更高效的生化流程捕获更多 的基因，实现对基因表达和细胞变化过程的精准解析，我们对该方案进行了全面升级。 在保持 Stereo-seq 高检测分辨率的基础上，升级后的时空转录组 FF V1.3 的整体性能更优异，可助力研究人员轻松获得更多高质量数据， 结合全新升级的数据分析工具 ， 真 正实现 Cellbin 水平深入探索和揭示细胞基因表达的奥秘。
比较前期 V1.2 版本，升级后的时空转录组 FF V1.3 的整体性能更优异，在保持原分辨率 500nm 基础上，捕获基因数显著提升，工作流程更快速简便，可以轻松完成 CellBin 分析，实现真正意义上的空间单细胞分 析。目前，时空转录组 FF V1.3 兼容 1cm×1cm 和 0.5cm×0.5cm 的芯片，两种尺寸都兼容同片 ssDNA 染色 /H&E 染色以及单细胞分割。
图 Stereo-seq 芯片大小
1、Stereo-seq 芯片上布满了数十亿规则阵列排布的单链线球状 DNA 纳米球（DNA NanoBall，DNB）。DNB 是以单链环状 DNA 为模版，经过滚环扩增得到的产物，每个 DNB 直径为 220nm，两个 DNB 中心点间距 范围为 500nm。
2、通过 DNBSEQ 技术对固定在芯片上的 DNB 进行测序，得到 Coordinate ID(CID) 信息，CID 和 DNB 坐标 位置一一对应，可以通过建立 CID 与坐标位置的映射关系，还原后续捕获到的 mRNA 的空间为止。芯片上所有点的 CID 序列信息，都被编制成一个叫“MASK”的文件，这个 MASK 文件包含了每个点上 CID 序列的信息，后续用于分析。
3、DNB 经 Stereo-seq 生物方法合成携带 CID 的 DNB 后链接分子编码（Molecular ID，MID 用于区分不同 转录本）和 Poly T 序列，后续可以实现对游离 mRNA 的捕获。
4、组织样本贴在芯片上，经过透化、反转录、二链合成、建库、测序等步骤，将样本中的基因信息准确获取。
图 Stereo-seq 技术原理
5、空间转录组数据分析的核心是根据每个芯片上每个 bin 的基因表达信息进行聚类，然后将 bin（cell bin）根据坐标位置序列放回到组织的图像上，同时可以对每个 gene 在组织上表达的空间位置进行定位。Stereo-seq 分析软件包括 Stereo-seq 分析流程软件包（Stereo-seq Analysis Workflow, SAW）和 StereoMap（ImageStudio 已合并入 StereoMap）。SAW 主要用于分析空间基因表达数据，StereoMap 是一款 桌面端可视化软件，可以实现图像处理和交互式可视化探索。全新的分析软件功能更加强大，操作更加简单、5 伯豪生物华大时空转录组 FF V1.3 基因表达解决方案易用，以单细胞级分辨率（CellBin）轻松解析基因表达空间特征、探索全转录组空间奥秘。伯豪生物除了提 供 bin 基因数和 UMI 数统计、切片 bin 聚类和聚类亚群 marker 基因分析等基础和高级分析，同时还提供个性 化分析，如特定 pathway 功能富集分析等。
图 聚类结果及切片 bin 位置分布展示
图 每个 bin 特异表达的基因数统计
6、结合组织区域分布对数据进行挖掘
大部分组织其实是有其特定的区域划分的，比如说大脑里有皮层、丘脑、海马、脉络丛等多个区域。 将组织的区域划分和亚群（或细胞类型）的分布结合起来还是能发现很多有价值的信息的。
可以根据不同区域特异表达的 maker 基因的分布来判断每个区域在组织切片上的位置。 例如皮层 marker 基因 STX1A 的表达分布，海马 marker 基因 HPCA 的表达分布等
7、结合病理学特征对数据进行挖掘
空间转录组技术正真的精髓不是研究细胞亚群的分布，而在于将它在空间位置上体现的异质性跟组 织病理学特征的分布进行结合，挖掘在不同病理学特征下转录组学的差异。这对于研究疾病病变的机制、帮助临床实现更好的患者分子分型、以及空间位置 Biomarker 的挖掘方面都是非常有价值的。通过手动把这些区域圈出来进行转录组层面的比较，找出不同病灶区的特异性 marker，分析疾病在一步步发展进程中生物学功能的变化，甚至可以思考一下是否能找出一些关键性因子来阻断疾病的进展。
8、空间转录组联合单细胞 RNA 测序解析细胞类型的空间位置信息（Multimodal intersection analy-sis,MIA)
空间转录组测序可以获得不同基因在组织切片上的空间位置信息，但不能获得详细的细胞类群信息（空间转录组不是单细胞分辨率，只能粗略的分析切片上不同位置的细胞类型）。因此，需要借助但细胞测序数据来分析细胞类型，然后通过生物信息学的分析方法将单细胞类群映射到空间转录组数据上。
备注： MIA 热图，上方的颜色条反映了 ST 区域的子聚类（cancer region，Pancreatic tissue，Duct epithelium 和 stroma）。
左侧代表不同的细胞类群。
色块代表 enrichment 或者 depletion。
Enrichment 代表该细胞类群富集到了该区域。
Depletion 代表该细胞类群在该区 域缺失。
1、捕获基因数显著提升：
基于同组织相邻切片、相同数据饱和度下，统计了已测试的所有组织样本，Bin20 水平捕获的 Median Gene Type 提升中位数比例为~149%。Meidan MID 提升中位数比例为~224%。捕获效率显著提升，助力进行更深入的单细胞空间分析。
2、轻松实现 Cellbin 分析：
通过图像识别技术，对细胞核进行识别和分割并获得 Celbin。基于 Cellbin 水平捕获到的更多空间转录组信息，以单细胞分辨率精细探索基因表达空间特征。
3、样本质量兼容性更高：
RIN 值的质控要求调整为 RIN≥4，允许检测更多长期保存的降解度更高的样本，样本质量兼容性更高。
4、同试剂盒支持同片细胞核 /H& E 染色：
H&E 封片剂集成进试剂盒，支持同一套试剂盒在同一张切片上灵活选择 ssDNA 染色 /H&E 染色，开展多 模态数据分析及挖掘。
5、有效提升透化荧光信号强度：
透化试剂升级后，可以有效提升透化荧光信号强度，更有利于选择最佳透化时间。
6、工作流程更快速便捷：
实现部分试剂预混，试剂管数减少，生化流程整体可缩短~4 小时，操作更简单流畅，研究人员 1 天即可获得纯化后的 cDNA 产物。
7、分析工具强大且易用
全新升级的数据分析工具安装配置和操作使用更简单便捷，交互友好性更强，可视化能力更丰富，可兼容所有第三方分割算法的结果。
1、新鲜组织样本包埋
目前新鲜组织的包埋方法有两种，一种是液氮 + 异戊 烷法；另一种的干冰法。对于临床手术切下来的组织样本一般使用干冰的包埋方法。对于穿刺样本等一些较小，较轻的样本，一般推荐用液氮 + 异戊 烷的方法 进行冷冻。OCT 包埋组织块可以在‒80ºC 的密封容器中长期保存，或立即进行冷冻切片。有些样本比较特殊：肺组织，脑（人 + 小鼠 + 大鼠）这种样本取下后，不要放入在任何液体里，如果表面有血液，只需要用 PBS 冲洗擦干后，进行包埋。
2、冷冻切片、组织样本质控及贴片
由于空间转录组检测的是组织中的 RNA，因此要对切片中的 RNA 质量进行检测。我们一般取 10 片组织切片进行 RNA 抽提并质检，确定组织中 RNA 完整性（华大 V1.3：RIN>4）。所以要求我们的组织样本至少有 1cm 的厚度，以便完成所有的实验。
3、组织优化
进行组织优化芯片探索的目的是摸索样本的最佳透化条件，保证组织切片中的 mRNA 能够充分释放。该步骤是获取真实实验结果的必要条件。否则，我们无法判断是基因表达高低到底是否是因为透化不充分导致。因此：每个样本建议都要做透化，尤其是临床样本。
空间位置信息，或者细胞在组织中天然的状态在研究过程中其实具有十分重要的价值，特别针对某些 研究领域，如发育生物学（不同位置的细胞接受不同的信号浓度梯度、响应不同的外界刺激，具有不同的发 育命运）、肿瘤生物学（肿瘤组织与癌旁组织的区别，肿瘤细胞侵润过程中肿瘤细胞的变化与对正常细胞的 影响，肿瘤转移的不同过程阶段等）、脑神经科学（不同脑区位置的神经元结构、神经连结，中间神经元投射，突触前后，神经胶质相互影响等等），细胞来源的位置信息是极为关键的决定因素。常见空间转录组的应用方向主要在肿瘤学，免疫学，发育生物学，神经科学及病理学等方向。
图 空间转录组的应用方向
