透射电镜观察自噬体

一、技术简介
透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是使用最为广泛的一类电镜。通过发射电子束从而穿过超薄的样品，同时与样本相互作用，既而形成图像。透射电镜具有分辨率高和放大倍数高的优点。其分辨率为0.1-0.2nm，放大倍数为几万到几十万倍。目前透射电镜已经广泛的应用到癌症研究，病毒学研究，微生物学，细胞学研究等生物领域。
透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备超薄切片(通常为50-100 nm)。要在机体死亡后的数分钟内取材，组织块要小(1mm3以内)，常用戊2醛和锇酸双重固定，包埋介质包埋，用超薄切片机切成薄片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。
自噬体是自噬的标志性结构。自噬体属于亚细胞结构，直径一般为300～900nm，平均500nm，普通光镜下看不到。通过透射电子显微镜发现自噬体一直是观察自噬现象最直接、最经典的方法，是自噬检测的“金标准”。
二、实验流程
透射电镜生物样品制备步骤：
1. 固定：用2.5%的戊2醛固定2小时。
2. 锇酸固定：用2%的锇酸固定2小时。
3. 脱水：用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min(70%乙醇中过夜)，再用100%乙醇脱水3次，每次20min。
4. 置换：用bing酮置换2次，每次15min。
5. 浸渍：
a．bing酮：包埋剂=1：2的浸渍液浸渍4h；
b. 纯包埋剂浸渍2次，每次4h。
6. 包埋：将样品放入盛有纯包埋剂的包埋板中。
7. 聚合：将包埋板置于65℃条件下各聚合48h以上。
8. 修块：将包埋头修成梯形，且样品表面积小于0.2mm×0.2mm。
9. 超薄切片：切片机切片 50-70 nm。
10. 染色：3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色。
11. 透射电镜观察，拍片。
三、服务说明及结果
1. 客户提供：细胞数需≥10⁶。
2. 公司提供：基本实验步骤、药品、细胞处理、图片及图片分析。
3. 实验周期：25-30个工作日。

附：细胞透射电镜样本制备
1. 细胞数量：＞1*10的6次方。
2. 消化细胞时要注意不要过度，及时用含血清的培养液终止消化。
3. 终止消化后，预冷的PBS（pH 7.4 ）洗细胞1-2次，离心（1500rpm，5min）弃上清（细胞最好收集在1.5ml的EP管中）。
4. 加入1mL 2.5% 戊2醛溶液（需用PBS配制该溶液），可用吸管轻轻吹散细胞，使细胞悬浮于固定液中。
5. 在4℃固定过夜后寄出（寄送时加冰袋，并用2.5% 戊2醛溶液将EP管中剩余空间充满）。
注意：药物处理特别注意不能处理过度，否则收集的细胞都是死细胞，不利于电镜观察。