铁死亡（Ferroptosis）

一、铁死亡简介

 铁死亡（Ferroptosis）最早是2012年由Brent R. Stockwell提出的[1]，研究发现Erastin可以特异性诱导Ras突变细胞死亡，但是没有典型的细胞凋亡特征，铁螯合剂可以抑制这一过程，并且另一种化合物RSL3也有类似的细胞死亡表型[2, 3]。与经典的细胞凋亡不同，铁死亡过程中没有细胞皱缩，染色质凝集等现象，但会出现线粒体皱缩，脂质过氧化增加。传统的细胞凋亡，细胞自噬，细胞焦亡的抑制剂不能抑制铁死亡过程，但铁离子螯合剂可以抑制这一过程，说明铁死亡是铁离子依赖的过程。

基础研究中经常涉及到对多种细胞死亡方式的研究，如细胞自噬、凋亡、焦亡等。细胞铁死亡是最近几年才被发现的一种细胞死亡方式，目前对它的形态学、生物学、机制通路有了部分了解，但铁死亡过程涉及多种机制，受到信号通路的精密调控，铁死亡与疾病的发生有何种联系，是否与其他细胞死亡方式联合介导疾病的进展，因此，进一步深入研究铁死亡的作用机理，研究其在不同疾病类型中的作用，对寻找相关疾病的治疗靶点、靶向药物的研发具有重要意义。

铁死亡相关特征

（1）形态学特征：超微结构显示，铁死亡时细胞膜断裂和出泡，线粒体萎缩、线粒体脊减少甚至消失、膜密度增加、细胞核形态正常，但缺乏染色质凝集；电镜下观察到胞内线粒体变小、双层膜密度增高。
（2）生物学特征：活性氧（ROS）增加、铁离子聚集，激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）系统，通过降低胱氨酸的摄取、耗竭谷胱甘肽，抑制ystem Xc-和增加还原型酰腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，释放花生四烯酸等介质。
（3）免疫学特征为损伤相关分子模式（damage-associatedmolecular patterns molecules，DAMPs）释放前炎症介质（如高迁移率族蛋白B1等）。
（4）基因水平：主要受核糖体蛋白L8（ribosomalprotein L8，RPL8），铁反应元件结合蛋白（ironresponse element binding protein 2，IREB2），ATP合成酶F0复合体亚基C3（ATP synthase F0 complex subunit C3，ATP5G3），三四肽重复结构域35（tetratricopeptide repeat domain 35，TTC35），柠檬酸合成酶（citratesynthase，CS），酰基辅酶A合成酶家族成员2（acyl-CoAsynthetase family member 2，ACSF2）以及受代谢、储存基因TFRC、ISCU、FTH1、FTL、SLC11A2的调节。
铁死亡的实质是细胞内脂质氧化物代谢障碍，在铁离子催化作用下代谢发生异常，当细胞抗氧化能力减弱，脂质活性氧堆积，使细胞内氧化还原失衡，诱导细胞死亡。

二、铁死亡机制

（1）抑制GPX4诱导铁死亡：GPX4 能降解小分子过氧化物和某些脂质过氧化物，抑制脂质过氧化。研究发现，若细胞中 GPX4 表达下调则会对铁死亡更敏感；相反，若上调 GPX4 的表达，则会产生对铁死亡的耐受。因此，将GPX4抑制后将诱导细胞发生铁死亡。
（2）抑制胱氨酸谷氨酸转运受体 (systemXC-)诱导铁死亡：通过systemXC-，谷氨酸与胱氨酸以1:1比例交换，因此，谷氨酸的水平会影响到systemXC- 的功能。细胞外高浓度的谷氨酸会抑制systemXC-从而诱导铁死亡。敲除systemXC-的小鼠由于细胞外谷氨酸水平减少，可以防止神经毒性损伤。
（3）p53介导铁死亡：p53是一种抑癌基因，通过下调systemXC-组分SLC7A11的表达抑制细胞对胱氨酸的摄取，导致谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，削减细胞抗氧化能力，增强细胞对铁死亡的敏感性。同时，研究发现，在人肿瘤细胞中SLC7A11过度表达，这种过表达能够抑制活性氧诱导的“铁死亡”，同时削弱p53 3KR介导的对肿瘤生长的抑制作用。

三、检测方法

1、新陈代谢
（1）细胞活性：CCK-8；
（2）铁水平检测：细胞内可以使用PGSK探针，流式细胞术或共聚焦显微镜检测细胞内铁含量的细胞膜透性染料，结果表明，在铁死亡的细胞中，PGSK的绿色荧光会减弱；或者使用Iron Assay Kit检测细胞、组织中的铁水平；

（3）活性氧水平：细胞内活性氧和脂质活性氧通过流式细胞术使用DCFH-DA（表达上调）或C11-BODIPY 荧光探针检测（在铁死亡细胞中，探针会由红色转化为绿色）；

（4）qRT-PCR/WB检测：检测与铁死亡相关的蛋白表达，如PTGS2、NOX1、FTH1、COX2、GPX4、ACSL4等，其中COX2、ACSL4、PTGS2、NOX1在铁死亡细胞中表达上调，GPX4、FTH1在铁死亡细胞中表达下调；

2、形态观察
（1）透射电镜直接观察细胞形态：细胞发生铁死亡时线粒体变小以及线粒体膜密度较大；

（2）线粒体观察：向细胞内转染LifeAct-GFP荧光蛋白，一段时间后用有丝分裂追踪器观察线粒体形态；


（3）线粒体膜电位检测：通过流式细胞仪收集TMRE阳性细胞的比例。

常用铁死亡研究常用试剂：
（1）System Xc抑制剂，Erastin 及其类似物 sulfasalazine, glutamate, and sorafenib
（2）GPX4 抑制剂，如RSL3，ML162
（3）FIN56可耗尽GPX4和CoQ10
（4）FINO2可间接抑制GPX4，诱导脂质过氧化
 

四、铁死亡与疾病的关系

1、铁死亡与肿瘤

        铁死亡在有关肿瘤的研究中成为近几年的热点之一。通过提高erastin衍生物的溶解度、分离度以及效价，其中的某些衍生物在异种移植肿瘤中已经初见成效。纳米颗粒诱导铁死亡也在异种移植研究中得到了证实。肿瘤抑癌基因p53能抑制 SLC7A11（systemXC-的组成部分），在某些情况下也能够诱导铁死亡的发生；核转录因子Nrf2能抑制肝细胞癌中铁死亡的发生；抑制Nrf2的表达能增强细胞铁死亡。
2、铁死亡与帕金森
        最近研究证明，铁死亡很有可能是引起PD神经退行性变细胞死亡的通路之一，铁是治疗PD的有效靶点。在细胞和MPTP诱导的PD小鼠模型中运用铁螯合剂（去铁酮），能减少氧化应激，增强多巴胺可利用性，从而改善现有的运动症状和减少运动功能的退化。早期阶段的PD患者中，应用去铁酮治疗可减缓运动缺陷的进展，减少现有的运动症状。在MPTP治疗前24小时给小鼠注射铁死亡抑制剂ferrostatin-1可显著挽救行为障碍和神经元丢失，这表明常见的PD毒素在动物模型中引起神经退行性变的机制可能是铁死亡。


3、细胞铁死亡与肝脏损伤的关系
该研究运用多种基因敲除小鼠模型，首次发现高铁状态以及遗传性血色病铁过载可诱发肝脏（肝细胞及巨噬细胞）发生铁死亡，并且揭示了转运蛋白Slc7a11调控铁死亡的新机制，为肝脏损伤及血色病等系列重大疾病的防治提供了新思路。


参考文献
1. Dixon, S.J., et al., Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell, 2012. 149(5): p. 1060-72.
2. Yang, W.S. and B.R. Stockwell, Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-RAS-harboring cancer cells. Chem Biol, 2008. 15(3): p. 234-45.
3. Yagoda, N., et al., RAS-RAF-MEK-dependent oxidative cell death involving voltage-dependent anion channels. Nature, 2007. 447(7146): p. 864-8.
4. Stockwell, B.R., et al., Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell, 2017. 171(2): p. 273-285.