CCK-8试剂盒(细胞增殖及毒性检测试剂盒)

CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8）是一种基于WST-8的快速、高灵敏度细胞活性检测的试剂盒，广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性甲臜化合物。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同种类型细胞，颜色深浅与细胞数量在一定限度内呈线性关系。

本试剂盒为即用型溶液，无需再行配制，可直接用于96孔板细胞实验，省略了细胞洗涤与收集等步骤。该试剂盒可用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

操作步骤：（仅供参考）

一、制作标准曲线

1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2.按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3.接种后培养至细胞贴壁，然后加CCK-8溶液培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。

4.根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。）

二、细胞活性检测

1.在96孔板中接种细胞悬液（100µL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在37℃，5% CO2的条件下）。

2.向每孔加入 10µL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5.如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10µL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮盖培养板在室温条件下避光保存。在24小时内吸光度不会发生变化。

 三、细胞增值-毒性检测

1.在 96 孔板中配置 100µL的细胞悬液。将培养板置于培养箱预培养24小时（在 37 ℃，5% CO2 的条件下）。

2.向培养板加入10µL不同浓度的待测物质。在培养箱孵育一段时间（例如：6、12、24或48小时）。

3.向每孔加入10µL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8溶液之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。

4.将培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5.如果暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入10µL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

活力计算：

细胞活力（％）=[A(加药)－A(空白)]／[ A(0 加药)－A(空白)]×100

A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培养基和 CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度

A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项：

1.本试剂颜色应为粉红色，如果发现溶液变黄应弃用。

2.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液。

3.本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

4.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间，白细胞可能培养时间较长。

5.当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔 (100µL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500 个/孔 (100µL培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

6.如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490nm之间的滤光片，但是450nm检测灵敏度最高。

7.培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

Hela细胞-增殖活力检测，37℃孵育2h

Hela细胞-标曲绘制