衰老骨髓中LepR+细胞衰老及H2O2积累和NO减少的检测
验证衰老骨髓中LepR+细胞衰老、H2O2积累和NO生成减少的现象
对年轻（2月龄）和衰老（20月龄）小鼠股骨骨髓进行免疫荧光染色检测P21、ASL、CD31、OCN、PERIPHERIN、LYVE1等；流式细胞术分析my-HSCs比例；qPCR检测LepR+细胞中SCF mRNA；H2O2探针检测H2O2水平；H2O2检测试剂盒定量H2O2浓度。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用一氧化氮纳米泵再生衰老骨髓
Regenerating aged bone marrow via a nitric oxide nanopump.
实验完整度
高包含体外细胞模型、动物模型及RNA-seq机制验证，并有功能与机制验证
主要模型
衰老C57BL/6小鼠（20月龄）骨髓LepR+细胞 年轻C57BL/6小鼠（2月龄）骨髓LepR+细胞 LepR-tdTomato小鼠
重点核对
LepR+细胞分选：使用抗LepR-biotin抗体及流式分选 CB-LepR表征：粒径125.9±0.25 nm，多分散指数未报告 体外NO释放：CB-LepR 50 μg/mL与H2O2（0、6.25、12.5、25、50 mM）共孵育 体内局部治疗：股骨骨髓腔内注射，CPPO剂量5.0 mg/kg 体内系统治疗：尾静脉注射，每2周一次，CPPO剂量5.0 mg/kg，8周后micro-CT
摘要
驻留的瘦素受体表达（LepR+）细胞在衰老骨髓中发生衰老，损害成骨细胞及其他谱系细胞的再生能力。本研究构建了一种靶向LepR+细胞、具有体内自控开启能力的一氧化氮（NO）纳米泵，用于 rejuvenate 衰老骨髓中的LepR+细胞。该纳米泵通过纳米沉淀过程将疏水性化学发光底物和NO供体共包封于两亲性聚合物基质中。NO纳米泵中的化学发光底物自动与衰老骨髓中积累的H2O2反应，然后将化学能直接转移给NO供体，诱导原位NO释放。衰老骨髓中原位产生的NO通过激活衰老LepR+细胞中的糖酵解信号，触发体内成骨细胞及其他龛的再生。总之，所构建的NO纳米泵是对抗衰老诱导的骨髓疾病的有前景的工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老骨髓中LepR+细胞衰老导致骨髓稳态崩溃，能否通过靶向LepR+细胞原位释放NO来逆转衰老并恢复骨髓稳态？
- 核心机制
- NO纳米泵在衰老骨髓中响应H2O2原位释放NO，NO通过激活衰老LepR+细胞中的糖酵解信号通路，逆转细胞衰老并促进成骨分化。
- 主要证据
- 体外实验显示CB-LepR清除H2O2并在LepR+细胞内释放NO，减少SA-β-Gal阳性衰老细胞，促进成骨分化；体内局部注射CB-LepR增加骨量、减少衰老LepR+细胞、改善血管/淋巴管/神经再生并降低my-HSCs比例；RNA-seq和Seahorse assay证实糖酵解通路激活。
- 研究意义
- 所构建的NO纳米泵可作为对抗衰老诱导的骨髓疾病的有前景的工具，为逆转骨髓衰老提供精准治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NO纳米泵的构建与表征
构建并表征共包封CPPO和BNN6的NO纳米泵，并验证其H2O2响应性NO释放
通过纳米沉淀法制备CB-NPs，共包封BNN6、CPPO、大豆油和DSPE-PEG-MAL；通过Traut's试剂将抗LepR抗体偶联到表面得到CB-LepR；用TEM、DLS、HPLC、EDS表征；用Griess试剂和DAF-FM DA探针检测NO释放；用LC-MS检测BNN6消耗。
CB-LepR在体内靶向LepR+细胞的效率评估
验证CB-LepR在体内对LepR+细胞的靶向能力
将CB-NPs或CB-LepR用CY5.5或FITC标记，注射到衰老小鼠股骨骨髓腔或LepR-tdTomato小鼠，7天后取股骨进行免疫荧光共定位分析；流式细胞术检测LepR+细胞结合比例；尾静脉注射后不同时间点进行全身荧光成像。
CB-LepR在体内清除H2O2和释放NO的能力检测
验证CB-LepR在衰老骨髓中清除H2O2并在LepR+细胞内释放NO
向衰老小鼠股骨骨髓腔注射CB-LepR，用H2O2探针和H2O2检测试剂盒检测H2O2水平；分选LepR+和LepR-细胞检测细胞内H2O2；用Griess试剂检测LepR+细胞内NO浓度；用活细胞成像观察NO释放。
CB-LepR体外逆转LepR+细胞衰老并促进成骨分化
验证CB-LepR对衰老LepR+细胞的抗衰老作用及对成骨/成脂分化的影响
LepR+细胞在含H2O2（100 μM）的条件下与CB-NPs或CB-LepR共孵育，进行SA-β-Gal染色、ALP染色、ARS染色和油红O染色；qPCR检测成骨（Alp、Ocn、Osx、Runx2）和成脂（Fabp4、Pparγ）基因表达。
CB-LepR局部治疗衰老小鼠骨髓的体内疗效评估
验证CB-LepR局部注射能否恢复衰老骨髓稳态
对衰老小鼠股骨骨髓腔局部注射PBS、CB-NPs或CB-LepR，8周后通过micro-CT分析骨参数；免疫荧光染色检测衰老、骨形成、脂滴和破骨细胞活性；检测my-HSCs比例；RNA-seq分析LepR+细胞基因表达。
CB-LepR通过激活糖酵解通路逆转LepR+细胞衰老的机制验证
验证NO纳米泵通过激活糖酵解信号通路逆转LepR+细胞衰老
对体外和体内LepR+细胞进行RNA-seq，进行KEGG和GSEA分析；用2-DG（糖酵解抑制剂）和L-NAME（NO合成抑制剂）干预，通过SA-β-Gal染色和P21免疫荧光检测衰老；qPCR检测Pkm2和Ldha表达；Seahorse assay检测ECAR。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证NO释放和H2O2清除
评估代谢功能
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| LepR+细胞分离与消化 | I型胶原酶 | Gibco | 17018029 |
| 中性蛋白酶 | Roche | 4942078001 | |
| DNA酶 | Thermo | 89836 | |
| HBSS缓冲液 | Gibco | 14170120 | |
| LepR+细胞分选 | 山羊抗LepR生物素抗体 | R&D Systems | BAF497 |
| 驴抗山羊FITC抗体 | Abcam | ab6881 | |
| NO纳米泵制备 | BNN6 | MedChemExpress | HY-164117 |
| 大豆油 | Aladdin | S110244 | |
| CPPO | Aladdin | B101611 | |
| DSPE-PEG-Mal | Shanghai ToYongBio Tech Co., Ltd. | -- | |
| 四氢呋喃 | Aladdin | T103263 | |
| Traut's试剂 | Aladdin | I106793 | |
| H2O2检测 | Amplex Red | Beyotime | ST010 |
| H2O2检测试剂盒 | Beyotime | S0021 | |
| NO检测 | DAF-FM DA | Beyotime | S0019 |
| Griess试剂盒 | Beyotime | S0021 | |
| 细胞毒性检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Solarbio | CA1210 |
| 活/死细胞染色试剂盒 | Solarbio | CA1630 | |
| 体内靶向检测 | 抗LepR-FITC抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8391 FITC |
| 体外衰老与分化诱导 | SA-β-Gal染色试剂盒 | Solarbio | G1580 |
| 体外成骨诱导 | 成骨诱导培养基 | OriCell | MUBMX-90041 |
| 体外成脂诱导 | 成脂诱导培养基 | OriCell | MUBMX-90031 |
| 体外成骨染色 | 碱性磷酸酶染色试剂盒 | Solarbio | G1480 |
| 茜素红染色试剂盒 | Solarbio | G1452 | |
| 体外成脂染色 | 油红O染色试剂盒 | Solarbio | G1262 |
| 免疫荧光染色 | 抗OCN抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-78870 |
| 抗ASL抗体 | Abcam | ab97370 | |
| 抗P21抗体 | Abcam | ab188224 | |
| 抗γ-H2AX抗体 | Abcam | ab81299 | |
| 抗IL-6抗体 | Abcam | ab290735 | |
| 抗PERILIPIN抗体 | Abcam | ab316115 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab222783 | |
| 抗LYVE1抗体 | Abcam | ab14917 | |
| 抗PERIPHERIN抗体 | Abcam | ab246502 | |
| 山羊抗兔FITC抗体 | Abcam | ab6717 | |
| my-HSCs分析 | 抗CD16/32抗体 | BioLegend | 101301 |
| 抗Lineage鸡尾酒同型对照-FITC | BioLegend | 133302 | |
| 抗Sca-1-APC | BioLegend | 108112 | |
| 抗c-Kit-PE/Cyanine7 | BioLegend | 105814 | |
| 抗CD48-PerCP/Cyanine5.5 | BioLegend | 103422 | |
| 抗CD150-PE | BioLegend | 162606 | |
| RNA提取与qPCR | TRIzol | Vazyme | -- |
| HiScript III逆转录试剂盒 | Vazyme | -- | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QuantStudio3实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Seahorse assay | Seahorse XFe96细胞外流量分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| micro-CT | SkyScan 1176微型CT | SkyScan | -- |
| 透射电镜 | Hitachi HT7800透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 动态光散射 | 动态光散射仪 | Malvern Instruments | -- |
| 高效液相色谱 | 高效液相色谱仪（Dionex系统） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 荧光显微镜 | Axio Imager 2荧光显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 流式细胞分析 | BD LSRII流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
| 动物荧光成像 | IVIS光谱成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 酶标仪 | 酶标仪 | BioTek | -- |
| 荧光显微镜 | Zeiss Axiovert 200荧光显微镜 | Carl Zeiss Inc. | -- |
| 流式细胞分选 | FACSAria流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LepR+细胞分选 | 酶消化浓度（I型胶原酶3 mg/mL、中性蛋白酶4 mg/mL、DNase 200 U/mL）及消化时间（37°C，15分钟×2次）；抗体孵育条件（山羊抗LepR-biotin 2小时4°C，驴抗山羊FITC 1小时） 阅读提示：Methods: Isolation and sorting of LepR+ cells；Supplementary Fig. 11分选策略 |
| CB-NPs和CB-LepR制备 | BNN6 0.75 mg、CPPO 1 mg、大豆油2 μL、DSPE-PEG-Mal 5 mg、THF 1 mL；抗LepR抗体500 μL（10 μmol）与Traut's试剂（200 μmol）反应1小时；CB-NPs与抗体混合物反应6小时 阅读提示：Methods: Preparation of CB-NPs and CB-LepR |
| 体外NO释放检测 | CB-LepR浓度50 μg/mL，H2O2浓度0、6.25、12.5、25、50 mM，37°C水浴；DAF-FM DA浓度5 μM，孵育20分钟37°C 阅读提示：Methods: Characterizations of NO generation；Fig. 3H |
| 体内局部治疗 | CPPO剂量5.0 mg/kg，股骨骨髓腔内注射，8周后检测；每组n=5只小鼠 阅读提示：Methods: In vivo therapeutic efficiency；Fig. 7A |
| 体外衰老与分化诱导 | H2O2浓度100 μM（成骨/成脂诱导）或200 μM（衰老诱导）；CB-NPs或CB-LepR浓度50 μg/mL；成骨诱导7天和14天染色，成脂诱导21天染色；SA-β-Gal染色在7天后 阅读提示：Methods: In vitro aging, osteogenic and adipogenic induction；Fig. 6A |
| Seahorse assay | 细胞数1×10^7，处理24小时；依次加入葡萄糖（10 mM）、寡霉素（1 μM）、2-DG（50 mM） 阅读提示：Methods: Extracellular acidification rate measurements with the Seahorse assay；Fig. 8H–J |
| micro-CT扫描 | 各向同性体素大小3.5 μm，低密度阈值90，感兴趣区域为股骨远端骨骺 阅读提示：Methods: Micro-CT imaging；Fig. 7B–F |