PSCC肿瘤微环境单细胞图谱构建
解析PSCC TME的细胞组成及HPV+与HPV-差异
对23例PSCC肿瘤和5例癌旁组织进行scRNA-seq，质控后获得202,424个细胞，聚类注释四大细胞类型及免疫亚群
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B细胞-IgA-上皮轴增强抗肿瘤免疫并改善HPV相关阴茎鳞状细胞癌的预后
A B cell-IgA-epithelial axis enhances antitumor immunity and improves outcome in HPV-associated penile squamous cell carcinoma.
实验完整度
高scRNA-seq、IHC/mIF、流式、ELISA、BCR-seq、体外功能及两种小鼠模型验证
主要模型
23例未经治疗PSCC患者肿瘤及5例癌旁组织（scRNA-seq） 85例PSCC患者FFPE组织队列（IHC验证） PSCC患者来源原代细胞 MC38小鼠结肠癌皮下移植瘤模型（C57BL/6及IgA-/-小鼠）
重点核对
HPV状态判定：p16 IHC强弥漫核质染色≥70%且HPV PCR约180bp条带为阳性 scRNA-seq人源PSCC原代细胞PIGR过表达后CCK-8、克隆形成、Transwell及PI/Annexin V凋亡检测 裸鼠皮下接种1×10^7 PSCC原代细胞（对照或PIGR过表达）观察肿瘤生长 C57BL/6小鼠皮下接种5×10^5 MC38细胞（对照或PIGR过表达），抗CD20抗体250μg/只每10天腹腔注射清除B细胞 IgA-/-与野生型小鼠接种MC38细胞比较肿瘤生长及CD8+ T细胞浸润
摘要
阴茎鳞状细胞癌（PSCC）是一种罕见且侵袭性强的恶性肿瘤，约50%的病例由HPV驱动，并与较好的预后相关。在本研究中，我们对23例未经治疗的PSCC患者的肿瘤微环境（TME）细胞进行了单细胞RNA测序，其中包括先前报道的11例，并在一个更大的85例患者队列中验证了我们的发现。我们的分析揭示了PSCC中显著的免疫细胞浸润，HPV+肿瘤表现出更高水平的肿瘤浸润B细胞、浆细胞、三级淋巴结构和IgA分泌。HPV+ PSCC中一部分恶性上皮细胞表达聚合免疫球蛋白受体（PIGR），促进IgA跨细胞转运并诱导抗肿瘤反应。功能研究表明，PIGR过表达促进肿瘤凋亡并增强免疫反应，而这些效应在IgA缺陷小鼠中减弱。升高的IgA和PIGR表达与改善的生存相关。这些发现提供了PSCC TME的单细胞图谱，突显了B细胞–IgA–PIGR轴作为HPV+ PSCC中抗肿瘤免疫和临床结局的关键驱动因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HPV+ PSCC预后优于HPV- PSCC的免疫微环境机制尚不清楚，本研究旨在探索TME差异及B细胞-IgA-PIGR轴的作用。
- 核心机制
- HPV+ PSCC中IFN-γ升高诱导恶性上皮细胞表达PIGR，PIGR介导IgA跨细胞转运，进而促进肿瘤细胞凋亡并增强抗肿瘤免疫反应。
- 主要证据
- scRNA-seq发现HPV+ PSCC中TIL-Bs、TLSs、IgA和PIGR+上皮细胞增多；IHC/mIF/ELISA/流式在85例队列中验证；PSCC原代细胞过表达PIGR后增殖、迁移减少、凋亡增加；MC38模型中PIGR过表达抑瘤作用在IgA-/-小鼠中减弱。
- 研究意义
- 提供了PSCC TME的单细胞图谱，将B细胞–IgA–PIGR轴确定为HPV+ PSCC抗肿瘤免疫和临床结局的关键驱动因素，升高的IgA-PIGR水平可能作为PSCC及其他黏膜相关癌的预后生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HPV+与HPV- PSCC免疫细胞组成差异验证
验证HPV+ PSCC中TIL-Bs和TLSs的富集
对新鲜肿瘤组织进行流式细胞术检测CD45+免疫细胞及TIL-Bs比例；对85例FFPE切片进行CD20/CD3双重IHC和mIF检测TLSs
IgA/IgG表达及IgA与生存相关性分析
明确HPV+ PSCC中IgA水平升高及其与预后的关系
对85例FFPE切片进行CD138、IgA、IgG IHC评分；对13例新鲜肿瘤及配对血浆进行ELISA；对20例新鲜肿瘤进行bulk BCR-seq
恶性上皮细胞异质性及PIGR+亚群鉴定
探究HPV+ PSCC上皮细胞中PIGR的表达及调控因素
用inferCNV鉴定9255个恶性上皮细胞并聚类；IHC/mIF验证PIGR表达及IgA-PIGR共定位；用IFN-γ等刺激PSCC原代细胞检测PIGR表达
PIGR过表达对PSCC细胞功能及体内成瘤的影响
验证PIGR过表达的抗肿瘤作用
构建慢病毒PIGR过表达PSCC原代细胞，检测增殖、克隆形成、迁移；裸鼠皮下成瘤观察肿瘤生长
IgA-PIGR轴体外抗肿瘤功能验证
验证IgA与PIGR结合对PSCC细胞增殖、迁移和凋亡的影响
对PIGR过表达或对照PSCC原代细胞给予IgA处理，进行RNA-seq、qPCR、CCK-8、克隆形成、Transwell及PI/Annexin V凋亡检测
IgA-PIGR轴体内抗肿瘤作用及免疫细胞浸润分析
在免疫健全小鼠中验证IgA对PIGR介导抑瘤作用的必要性
将对照或PIGR过表达MC38细胞接种野生型及IgA-/- C57BL/6小鼠；用抗CD20抗体清除B细胞；流式检测CD8+ T细胞浸润及细胞因子
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| HPV DNA提取 | 动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒 | Solarbio | D1700 |
| TIANamp FFPE DNA试剂盒 | Tiangen | DP331 | |
| HPV DNA原位杂交 | HPV检测试剂盒 | Triplex International Biosciences | HPV high-risk-20A |
| 免疫组化 | 鼠抗人p16抗体 | MXB-bio | MAB-0673 |
| 鼠抗人CD3抗体 | ZsBio | ZM-0417 | |
| 鼠抗人CD20抗体 | ZsBio | ZM-0039 | |
| 兔抗人CD138抗体 | ZsBio | ZA-0584 | |
| 兔抗人IgA抗体 | ZsBio | ZA-0446 | |
| 兔抗人IgG抗体 | ZsBio | ZA-0448 | |
| 兔抗人PIGR抗体 | Abcam | ab96196 | |
| 兔抗人IFN-γ抗体 | Abcam | ab25101 | |
| 多重免疫荧光 | 柠檬酸盐缓冲液 | Akoya Biosciences | NEL811001KT |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Solarbio | C8160-100mg |
| 流式细胞术 | Zombie NIR活性染料 | BioLegend | -- |
| 人TruStain FcX封闭剂 | BioLegend | -- | |
| 抗人CD45抗体 | BioLegend | HI30 | |
| 抗人CD3抗体 | BioLegend | OKT3 | |
| 抗人CD19抗体 | BD BioLegend | HIB19 | |
| 抗人CD4抗体 | BD Biosciences | RPA-T4 | |
| 抗人CD8抗体 | BD Biosciences | RPA-T8 | |
| 细胞刺激 cocktail | eBioscience | -- | |
| 抗小鼠CD45.2抗体 | BioLegend | 104 | |
| 抗小鼠CD11b抗体 | BioLegend | M1/70 | |
| 抗小鼠TCRβ抗体 | BioLegend | H57-597 | |
| 抗小鼠CD8α抗体 | BioLegend | 53-6.7 | |
| 抗小鼠GZMB抗体 | BioLegend | QA16A02 | |
| 抗小鼠IFN-γ抗体 | BioLegend | XMG1.2 | |
| 抗小鼠TNF-α抗体 | BioLegend | MP6-XT22 | |
| 细胞培养 | PSCC原代肿瘤细胞培养基 | Hefei PreceDo Medical Laboratory Co., Ltd. | PRS-PECM-2D |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma | TR-1003 |
| DAPI染料 | BioLegend | 422801 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 抗小鼠PIGR抗体 | Abclonal | A6130 | |
| 抗HA单克隆抗体 | Proteintech | 66006-2-Ig | |
| 抗β-actin单克隆抗体 | Abcam | ab8226 | |
| ELISA | 人IgA SimpleStep ELISA试剂盒 | Abcam | ab196263 |
| 人IgG SimpleStep ELISA试剂盒 | Abcam | ab195215 | |
| 小鼠IgA SimpleStep ELISA试剂盒 | Abcam | ab157717 | |
| 小鼠IgG SimpleStep ELISA试剂盒 | Abcam | ab157719 | |
| CCK-8 | CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒 | Solarbio | CA1210 |
| B细胞清除 | 抗CD20抗体 | BioLegend | SA271G2, Cat#152116 |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Biosharp | BS165-100mg |
| DNaseI | Biosharp | BS137-10mg | |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3'试剂盒v3 | 10x Genomics | -- |
| Countess II自动细胞计数仪 | Thermo Fisher | -- | |
| BCR-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| KC-Digital链特异性BCR-seq文库构建试剂盒 | Seqhealth Technology | -- | |
| RNA-seq | TRNzol通用总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP424 |
| KC-Digital链特异性mRNA文库构建试剂盒（Illumina） | Seqhealth Technology | DR08502 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HPV状态判定 | p16 IHC阳性标准：强弥漫核质染色≥70%肿瘤细胞；HPV PCR使用SPF1/GP6++引物，约180bp条带为阳性 阅读提示：Methods 'HPV status definition'及Supplementary Table 6 |
| scRNA-seq样本与质控 | 发现队列23例肿瘤和5例NATs；细胞质控标准：基因数200-5000，线粒体基因比例<10%；测序饱和度63.2% 阅读提示：Methods 'Alignment, quality control of scRNA-seq data'及Supplementary Table 4,5 |
| 流式细胞术检测TIL-Bs | 新鲜肿瘤组织消化条件：5mg/mL IV型胶原酶，37°C 0.5h；抗体克隆号及稀释比例；HPV+ 9例，HPV- 11例 阅读提示：Methods 'Flow cytometry'及Fig. 2E, F |
| IHC评分标准 | CD138、IgA、IgG评分0-4分，高表达≥3，低表达≤2；PIGR和IFN-γ按阳性信号强度四分位数评分 阅读提示：Methods 'IHC Scoring of CD138, IgA, IgG, PIGR and IFNγ' |
| PIGR过表达细胞功能实验 | 慢病毒感染72h，polybrene 8μg/ml；CCK-8每孔2000细胞；克隆形成每孔200个细胞（PSCC原代2000个）；Transwell每孔10,000细胞 阅读提示：Methods 'Cell lines and PSCC primary cells'、'CCK-8 proliferation assays'、'Colony-formation assays'、'Transwell migration assays' |
| MC38体内实验及B细胞清除 | MC38接种量5×10^5细胞/只；抗CD20抗体250μg/只，接种时及每10天腹腔注射；IgA-/-小鼠8周龄C57BL/6J背景 阅读提示：Methods 'Mice and xenograft tumor models'及Fig. 6A, G |