高保真长片段Taq DNA聚合酶

特别提示：包括高保真长片段Taq DNA聚合酶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：高保真长片段Taq DNA聚合酶
英文名称：Long Taq DNA polymerase
产品货号：WH0071
产品规格：250U|500U

本制品是的具有3´-5´外切酶活性的耐热DNA聚合酶，具备扩增效率高，保真性能强的特点。配备两种高效扩增Buffer,可适应不同模板的扩增，对简单模板可扩增长达40kb的片段，对复杂二级结构（GC rich等）和具有重复序列的模板可扩增长达15kb的片段。PCR产物可直接进行T/A载体克隆，如需提高克隆效率，建议先纯化，加A后再进行T/A载体克隆。适合于高保真的长片段及一些复杂模板（如含二级结构，富含GC序列和重复序列等）的扩增，如构建基因图谱、测序及分子遗传学研究等。

产品组成：

组分	WH0071-1	WH0071-2
Long Taq DNA Polymerase	250U	500 U
10×Long Taq BufferⅠ	1.8ml	1.8ml
10×Long Taq BufferⅡ	1.8ml	1.8ml

配备两种高效扩增Buffer，即10×Long Taq BufferⅠ和BufferⅡ，可适应不同模板的扩增，请先使用BufferⅠ，当使用BufferⅠ不能扩增时，再试用BufferⅡ。

储存条件：-20℃保存

活性定义：
1单位（U) Long Taq DNA Polymerase活力定义为在74℃、30min内，以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，将10nmol的脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。

质量控制：
SDS-PAGE检测纯度大于99%；经检测无外源核酸酶活性；PCR方法检测无宿主残余DNA；能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；室温存放一周，无明显活性改变。

使用举例：
注意：以下举例为常规PCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物长短等具体情况，设定zuì佳反应条件。以人基因组DNA为模板，扩增10 kb的片段
1.反应体系的建立：50μl反应体系如下（可根据比例放大或缩小反应体系)：

组份	体积
Template	<1μg
Primer 1（10μM)	1 μl
Primer 2（10μM)	1 μl
10×Long Taq BufferⅠ	5 μl
dNTP Mixture（2.5mM)	4 μl
Long Taq （2.5 U/μl)	0.5-1 μl
ddH2O	补至50μl

2．PCR反应循环的设置：
  
3．结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。

除了高保真长片段Taq DNA聚合酶,，我公司还供应以下相关产品：



名称：SP6体外转录试剂盒
货号：BTN91107
规格：50次
本试剂盒是基于SP6 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有SP6启动子的模版DNA，以NTP为底物，从SP6启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需提供含SP6启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的zuì佳长度在20nt到2000nt之间。
5.产品配方经过精心优化，每μg DNA模版可以合成2-6μg RNA。
 得到的RNA可以用于RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。

试剂盒组成：

成分	规格
转录预配液(2×)	0.5mL
阳性对照DNA(1.3 kb片段)	20μL(10 ng/μL)
SP6 RNA聚合酶混合液	50μl
RNase-free水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有SP6启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将SP6启动子序列(5′ATT TAG GTG ACA CTA TAG AGN G 3′)加上，转录其实是从3端G AGN G中的第一个G开始。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有SP6启动子的载体，并且克隆位点必须位于SP6启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端zuì好不要是3′突出。如果是3′突出(如选择了Pst I来线性化质粒)，则zuì好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，zuì好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
二、体外转录反应
1.在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	备注
DNA模板	xμL	总量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段，建议用50 ng左右；如果模板是质粒DNA，建议用1μg左右；如果用本产品提供的阳性对照，建议用4μL)
SP6转录预配液(2×)	10μl	本成分还含其他促进剂，所以是混合物
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要订购NTP分开的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(本公司有各种加帽修饰核苷酸)。
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活SP6 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

若需进一步去除DNA模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。
1.在体外转录体系中加入3-5U自备的RNase-free DNase(BTN90903；3-5U/μL)。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL。
4. 用等体积(100μL)的Tris饱和酚-lǜ仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(BTN50903；用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

疑难解答：
1. 没有RNA产物。zuì常见原因是模板有RNase污染，可用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。还可以增加RNase Inhibitor用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2. RNA产量低。zuì常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基zuì好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3. RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有SP6 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6启动子)。
4. RNA长度比预计的长。SP6 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，zuì多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5. 5′单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长(如12小时)，则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则SP6 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5′端是单磷酸的比例将大大增加。
6. 如何得到带帽RNA？需加入带帽NTP类似物即可，本公司提供5种供选择。