Alexa Fluor 488/PI细胞凋亡检测试剂盒

特别提示：包括Alexa Fluor 488/PI细胞凋亡检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Alexa Fluor 488/PI细胞凋亡检测试剂盒
英文名称：Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit
产品规格：50次

  本试剂盒是一种采用Annexin V-Alexa Fluor 488与PI双染法进行细胞早期凋亡分析的检测试剂盒。
  细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝*酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就被破坏。另外一种活细胞非透过性荧光染料碘化丙啶不能通过完整的活细胞，但能够对坏死和凋亡晚期的细胞进行染色， 因此通常将Annexin V与PI配合染色， 以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡的晚期细胞。

试剂盒组成：

组份	50次
4×Binding Buffer	10ml
Propidium Iodide，PI	500μl
Annexin V-Alexa Fluor 488	250μl

注意事项：
1、消化细胞时不能用含EDTA的胰酶。
2、本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
3、需自备PBS和去离子水。
4、荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
5、PI对人体有刺激性，请注意适当防护。
6、请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤：

1、细胞样品的准备：
a．对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000×g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。
b．对于悬浮细胞：1000×g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的PBS，以避免吸走细胞。再次加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。

2、用去离子水按1:3稀释Binding Buffer(4ml Binding Buffer +12ml 去离子水)。
3、用 250μl Binding Buffer重新悬浮细胞，调节其浓度为 1×106/ml。
4、取 100μl的细胞悬液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-Alexa Fluor 488 和10μl 20μg/ml的PI溶液。
5、混匀后于室温避光孵育 15 分钟。
6、在反应管中加 400μl PBS，流式细胞仪(FACS)分析。

实验图例：

Jurkat细胞用顺铂诱导凋亡后用Annexin V-Alexa Fluor 488/PI双染流式分析图谱
储存条件：2～8℃，避光保存