技术原理与方法｜低色差物镜 PLAPON60XOSC 在脑组织四重免疫荧光分析中的应用

1. 低色差物镜 PLAPON60XOSC 在脑组织四重免疫荧光中的应用

在利用光学显微镜（如共聚焦显微镜）获取荧光图像之前使用荧光染料标记分子的方法，已成为可视化生物组织和细胞分子定位的最常用实验方法。

然而，由于显微物镜的色差所致的色差导致难以使用荧光染料精准显示紫外光和近红外区域中的细胞间共定位，因此在单个标本中很难实现多个细胞间共定位的准确可视化。奥伟登（Evident）低色差物镜 PLAPON60XOSC 即使在紫外和近红外区域也能以几乎没有色差的方式准确显示荧光标记分子。下面介绍使用四种类型荧光抗体在单个标本中准确可视化荧光标记分子的共定位情况。

PLAPON60XOSC 和 UPLSAPO60XO 的性能比较

2. 低色差物镜的应用-脑组织的四重免疫荧光

图 1. 脑组织的四重免疫荧光。

VIAAT 染色（Alexa Fluor405，蓝色）；CB1 染色（Alexa Fluor488，绿色）；VGluT3 染色（Cy3，红色）；DGLα染色（Alexa Fluor647，白色）。

大麻素合成酶 DGLα（白色）和大麻素受体 CB1（绿色）聚集在小鼠基底杏仁核的锥体细胞躯体（星号）周围，形成具有独特内陷结构的内陷突触（箭头）。这些侵入性突触表达囊泡抑制性氨基酸转运蛋白（VIAAT）（蓝色）和囊泡谷氨酸转运蛋白-3（VGluT3）（红色），表明其分别具有抑制性和兴奋性递质 GABA 和谷氨酰胺酸的神经化学特性。与此相比，如果未在其周围形成 DGLα簇，则抑制性突触的 CB1 阳性、VIAAT 阳性常见类型不表达 VGluT3，这表明其仅具有 GABA 的神经化学特性。比例尺：5 μm。

图 2. 脑组织的四重免疫荧光。

VIAAT 染色（Alexa Fluor405，蓝色）；CB1 染色（Alexa Fluor488，绿色）；VIP 染色（Cy3，红色）；DGLα染色（Alexa Fluor647，白色）。

GABAergic 篮状细胞有两种表达大麻素受体 CB1 并控制锥体细胞躯体的亚型，一种亚型表达胆囊收缩素（CCK），另一种表达血管活性肠肽（VIP）。这种四重免疫荧光染色显示，在高表达 CB1（绿色）和 VIAAT（蓝色）的阳性神经末梢（红色）周围缺乏 DGLα（白色），其表明 VIP 阳性神经末梢不参与侵入性突触的形成。比例尺：5 μm。

成像系统：

显微镜：奥伟登（Evident）共聚焦激光扫描显微镜 FV1200（奥伟登（Evident）现已推出全新 FV4000 共聚焦显微镜）

物镜：PLAPON60XOSC（60X, NA：1.4）

二极管激光器：405 nm，473 nm，559 nm，647 nm

3. 结论

如图（1）和（2）所示，针对多种功能分子和细胞标志物的四重免疫荧光可以提供有关细胞表达和亚细胞定位的详细信息，其中包括相关功能细胞与细胞间空间距离的相互依赖或独立关系。重要的是，显微镜的检测灵敏度和分辨率以及能够尽可能减小色差的物镜光学性能是实现免疫荧光目标的重要因素。