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表观生物
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肿瘤longRNA-seq
简介
LongRNA-seq是一种全面检测细胞和组织长片段RNA（>200nt） 的转录组测序方法,包括线性的mRNA和lncRNA分子，以及环状RNA，可准确高效揭示转录组的表达全貌，是非编码RNA的重要研究技术。
关于长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA):
lncRNA是一类长度大于200nt，无典型开放阅读框(ORF)的RNA，其数量远高于编码蛋白质的mRNA。它们的基因背景很丰富，可以是由启动子、增强子起始的序列，基因内含子，RNA的反义链，亦或是基因之间的序列等。研究发现lncRNA可在表观遗传学水平(包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重构)、转录及转录后水平调节基因的表达，从而参与各种基本生命活动和疾病的发生发展过程。
关于环状RNA（circular RNA，circRNA）：
环状RNA是一类特殊的RNA分子，是RNA领域的研究热点。
与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（ miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。而研究发现，还存在大量的环形RNA可作为信使RNA来编码蛋白，这些环形信使RNA通过一种常见的RNA甲基化修饰m6A，来驱动非帽依赖性的翻译机制来合成蛋白质。
正常情况下，真核细胞中蛋白质合成的主要方式是通过5’端帽依赖性翻译，但在应激环境下或一些癌症中，5’端帽依赖性翻译会被抑制而非帽依赖性翻译将会取代。因为环状RNA没有5’端帽结构，所以所有的环状RNA翻译都是通过非5’端帽依赖性翻译进行的。因而环状RNA可能通过产生刺激诱导蛋白在细胞应激反应中发挥重要作用。根据类似推理，环状RNA编码的蛋白可能在癌症等重大疾病发展过程中发挥重要作用。
实验流程
通过去 rRNA 链特异性建库方式，可以同时制备包含编码和非编码 RNA 信息的文库，后续通过不同的生物信息分析流程，获得同一样本中的 mRNA、lncRNA、circRNA 三套数据。
样本要求
建库方式
去rRNA 链特异性建库方式
测序参数
测序平台：HiSeq X10/4000
测序模式：PE150测序模式
测序数据：>10G clean data
分析内容
1. 测序原始 reads 去接头，质量控制
2. 参考基因组比对
3. 基因表达定量分析
4. mRNA 差异表达分析
5. lncRNA 差异表达分析
6. 差异 mRNA 基因 GO/KEGG 分析
7. circRNA 预测分析
8. circRNA 差异分析
9. 差异 circRNA host 基因 GO/KEGG 分析
高级分析
1. GSEA 分析
客户文章
1. Cell Mol Immunol：幽门螺杆菌感染中促进细菌定植与胃炎的新型基质细胞蛋白“TINAGL1”【1】
图1. 这篇文章使用RNA-seq用于识别感染幽门螺旋杆菌（H. pylori）的Ly6Chigh单核细胞和单核细胞来源的树突细胞（moDCs）中的差异表达基因
图5. A）HBx 转染后的差异表达热图；B）GSEA 分析比较 HBx 的DNA 结合转录因子活性；C）韦恩图显示 DNA 结合 TF 活性信号通路和 568 个驱动基因的交集
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文献和实验[1] Teng Y, Xie R, Xu J, et al. Tubulointerstitial nephritis antigen-like 1 is a novel matricellular protein that promotes gastric bacterial colonization and gastritis in the setting of Helicobacter pylori infection. Cell Mol Immunol. 2023;20(8):924-940. doi:10.1038/s41423-023-01055-4
[2] Zheng C, Liu M, Ge Y, Qian Y, Fan H. HBx increases chromatin accessibility and ETV4 expression to regulate dishevelled-2 and promote HCC progression. Cell Death Dis. 2022;13(2):116. Published 2022 Feb 4. doi:10.1038/s41419-022-04563-9
，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。 案例解读： 案例(一)RNA seq发现lincRNA 1. 2011年，Rinn研究小组对24种组织样本进行RNA测序发现了8000多个人的lincRNA 2. lincRNA的表达具有组织特异性 案例(二)lncRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物 2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。对64
检索：Phospho‐RNA‐seq: a modified small RNA‐seq method that reveals circulating mRNA and lncRNA fragments as potential biomarkers in human plasma. The EMBO Journal (2019) e101695④中国学者在青藏高原首次发现距今16万年的丹尼索瓦人遗骸由中国科学院青藏高原研究所陈发虎（CHEN Fahu ）和兰州大学张东菊（ZHANG Dongju）领导的一个
最新一期国际顶级学术期刊《Cancer Cell》杂志以论著形式发表了第二军医大学医学遗传学教研室的研究人员在肝癌转移方面的研究论文，报道了该课题组发现一种表达于人肝癌细胞中的长链非编码RNA（lncRNA），通过直接结合其他RNA分子，调控肿瘤微环境，促进肝癌的早期侵袭及晚期定植。第二军医大学医学遗传学教研室的袁继行博士和孙树汉教授分别是本文的第一作者和通讯作者。背景介绍肝癌是世界上最常见的一种侵袭性人类恶性肿瘤，其主要是由于肝内及肝外转移。目前，世界医学界及生物高技术领域高度重视肝癌
