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- 提供商：
表观生物
- 服务名称：
m5C BS-seq 修饰测序
产品介绍
m5C是RNA甲基化修饰中丰度较低的一种类型，但在肿瘤中的研究进展已经引起了广泛关注。近年来，随着高通量测序技术的发展，可以在转录组中很好的识别对包括m5C在内的各种核苷酸甲基化修饰。m5C修饰可以影响RNA的稳定性、可变剪接、翻译和转录后修饰等多个方面，从而对基因表达和细胞功能产生影响。虽然有大量关于m5C在tRNA和rRNA中的数据，但由于mRNA的丰度较低，且缺乏有效的分离纯化技术，对其在mRNA中的作用知之甚少。
为了推动mRNA m5C修饰研究，表观生物新推出单碱基分辨率的mRNA m5C BS-seq技术服务。该技术使用重亚硫酸盐对不含修饰的C进行处理，使其在PCR之后转换为T，而m5C修饰并不能进行该转换。结合体外合成全转录组无修饰RNA技术，在mRNA m5C BS-seq中加入IVT RNA作为负对照，得到高置信度的m5C位点，降低了检测结果中的假阳性率。
技术流程
分析内容
标准分析：
m5C BS-seq
1. 原始数据过滤、质控
2. 参考基因组比对
3. Peak calling
4. Peak注释
5. GO富集分析
5. KEGG富集分析
6. Motifs分析
7. 信号矩阵分析（Peak热图）
8. CIMS 分析
9. 可视化文件
10. 差异分析（如果有多组样品，进行差异分析，找出差异结合位点）
mRNA
1. 测序原始reads去接头，质量控制
2. 参考基因组比对
3. 基因表达定量分析
4. 基因注释
5. 差异表达分析
6. 差异基因热图绘制（仅限有生物学重复）
7. 差异基因GO分析
8. 差异基因KEGG分析
一、 质控及统计：
1. 原始数据质控
2. 比对统计
二、 m5C修饰水平概览：
1. m5C修饰平均水平统计 通过高通量测序和生物信息分析，识别甲基化富集的基因组区域。
2. m5C修饰位点的注释与基因元件分布情况
通过生物信息分析利用邻近基因对m5C进行注释。并根据注释信息，绘制m5C修饰在不同基因组特征上的比例图。
3. RNA甲基化位点Motif分析 RNA上甲基化的位点，可能包含某种序列motif。RNA甲基化酶可能正是通过识别这些 motif 特异性进行甲基化修饰，从而完成转录后调控功能。成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后，获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些 motif，从而揭示 RNA甲基化修饰的机制。
4. 基于全转录组组甲基化图谱的聚类 各个样品之间甲基化水平的比较，同时对甲基化的位点进行聚类分析，以识别在甲基化模式上相似的样本或基因。
三、 m5C修饰修饰位点及注释 1. 差异甲基化位点（DMC）鉴定与注释 识别两个/组样品间的差异甲基化位点，结合基因组注释信息中所有基因的位置信息及各个基因元件（5'UTR, CDS, intron, 3'UTR, ncRNA, tRNA）等位置信息，鉴定DMC与哪些基因的哪些基因元件有重叠，以此来判断DMC修饰哪些基因的哪些基因元件。 2. DMC 在染色体与基因元件上的分布情况 根据DMC的位置信息，统计DMC落在哪些染⾊体上，并⽤图形展示，以了解DMC在染⾊体上的分布有偏好性。同时根据DMC的位置信息，分别统计Hyper DMC及Hypo DMC 落在哪些基因元件上。
3. DMC修饰基因的功能富集 将鉴定出的DMC所修饰的基因，利⽤GO和KEGG数据库进⾏功能富集分析。对位于CDS区的Hyper-DMC和Hypo-DMC修饰的基因进⾏功能富集分析：① 对实验组相对于对照组甲基化⽔平升⾼的DMC（All-Hyper DMC）修饰的基因做功能富集分析；② 对实验组相对于对照组甲基化⽔平降低的DMC（All-Hypo DMC）修饰的基因做功能富集分析；富集分析采⽤Fisher检验，结合BH校正。富集分析结果包括表格和图⽚两部分，其中，表格为所有富集到的GO/KEGG条⽬，包括显著和不显著的。
样本要求
需要富集polyA mRNA
Total RNA：50ug
细胞：1.5*107
组织：25mg
测序数据量
10G/样本（免费赠送mRNA-seq 6G/样本）
项目周期
40个工作日
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文献和实验Zhang Z, Chen T, Chen H X, et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library[J]. Nature Methods, 2021, 18(10): 1213-1222.
for mRNA preparation; with less starting material, mRNA amounts may be too low to result in a good recovery. Ethanol precipitation may be done with 0.1 volume 3 M sodium acetate （pH 5.2） and 2.5 volumes ethanol at –20 °C overnight.It should be noted
新一代测序仪的飞速发展，使得测序成本大幅度下降，也使得甲基化组(methylome)的研究成为可能。近两年，多个研究小组利用高通量测序相结合，绘制出了多张甲基化图谱。 提到基于二代测序平台的全基因组研究，首先想到的必然是“金标准”BS-seq，即全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing)。该方法的实验原理是前期用Bisulfite处理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基
发展，使得测序成本大幅度下降，也使得甲基化组(methylome)的研究成为可能。近两年，多个研究小组利用高通量测序相结合，绘制出了多张甲基化图谱。 提到基于二代测序平台的全基因组研究，首先想到的必然是“金标准”BS-seq，即全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing)。该方法的实验原理是前期用Bisulfite处理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来，再结合高通量测序技术，特别
