AAV在心脏中的注射及表达

一、AAV注射方式介绍
AAV的注射方式，不同的文章中采用了不一样的注射方式。总体上，一般包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定点注射、心包内注射（介于心肌与心包膜之间），其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等（图3）。
尾静脉注射和心腔内注射由于病毒流进血液循环，分布较均匀。心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行，由于开胸腔手术需要辅助呼吸，对手术操作要求较高。心肌内定点注射时每点注射2-5ul，效果是在注射的局部点附近表达较高，但扩散非常有限。总的来说，很多实验直接用尾静脉注射即可，但是可能需要较高剂量的病毒，如果用心肌内定点注射，即小量多点注射，可以达到很好的感染表达效果，但是后者操作技术难度略高，也需要花费更长的操作时间。
结合新生鼠（出生2-10天）注射效果比较来看，新生鼠注射表达效果大大优于成年鼠，消耗病毒剂量也相对较低。新生鼠的注射，一般根据实验室的条件来看，可以选择颈静脉注射、面部静脉注射和心腔内（左心室）注射，目的是将病毒导入血液循环中。

图3 AAV9-EGFP不同注射途径小鼠后心肌表达效果（Cell Research. August，2016）

二、心脏表达常用启动子
一些常用启动子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用于驱动在心脏组织中的表达。很多高效的启动子由于片段较大，如αMHC，仅用于转基因小鼠等实验，不适合装载在AAV载体上。通过查阅文献，我们发现一些小的启动子如CMV在心脏组织的表达能力比较强，特别对于大片段的驱动效果很明显，但是如果需要介导的目的基因在心脏中特异性表达，则推荐使用cTnT启动子，cTnT常被用于心肌的特异性表达，表达能力也很强（图3-6）。

图4 不同启动子驱动的心肌表达效果（Genetic Vaccines and Therapy. September，2008）

图5 CMV和CBA（chicken β-Actin）启动子驱动的EGFP (AAV9)表达效果（Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. June，2015）

图6 CMV和cTnT启动子驱动luciferase的表达（AAV6）（Gene Therapy. January，2011）

近些年出现的基因组编辑工具，如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9，这些技术相比传统的同源重组来说作用效率更高。其中，以CRISPR/Cas9最受关注。CRISPR/Cas9的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA，以引导Cas9对双链DNA的切割。切割后造成剪切位点的DNA双链断裂（Double-strandbreak，DSB）。细胞内源修复机制随后启动进行修复，一种是非同源末端连接（Nonhomologousendjoining，NHEJ）修复途径，即断裂处直接连接或者会出现较高概率的插入缺失（indel）突变，导致编码CDS移码突变，蛋白往往提前终止，实现基因失活或者敲除（Knockout，KO）的目的；另一种是同源重组（Homologous recombination，HR），即存在修复模板情况下通过同源重组介导的修复，然后按照给定的模板进行修复，这种途径理论上可以设计模板而实现各种指定的突变（Knock-in，KI）。然而，两种修复途径在不同条件下突变效率可能差别非常大。NHEJ途径在多种细胞中发生的概率都比较高，用于受精卵可以高效获取KO小鼠，用于成体细胞可以容易获取KO细胞系。HR途径在大多数成体组织细胞中发生概率较低，相比较而言，此途径在干细胞、受精卵、早期胚胎中容易实现一些，包括细胞和小鼠的制备。
心脏一般认为是非增殖器官，同源重组概率极低。因此在心脏组织中应用CRISPR/Cas9方法几乎只能借助NHEJ修复途径得到移码突变。但是也可以通过同时使用2个sgRNA，使其切除一段DNA。如果sgRNA位于intron（intron大部分区域中的碱基插入缺失对exon剪接影响不大），几乎可以完美地删除exon，获取截短突变。
麻省理工大学张锋教授制作了第一例带有Cas9的Knock-in小鼠，即组成型表达和条件诱导型的Cas9 Knock-in小鼠，载体构建如下（图7）。

图7 Cas9 Knock-in小鼠构建示意图 （Cell. October，2015）

组成型表达Cas9蛋白的小鼠，从发育阶段开始会持续表达Cas9蛋白。持久高水平的表达Cas9蛋白会对细胞产生较强的毒副作用。研究中往往采取条件型Knock-in小鼠，搭配AAV病毒载体以表达Cre重组酶和根据目的基因设计的sgRNA，Cre通过重组切除Cas9蛋白前面抑制表达的loxp-STOP-loxp元件后，方可激活Cas9的表达，这样减少了发育积累过程中Cas9的毒副作用。并且启动Cre表达的区域局限于AAV感染表达的位点，能够实现组织定向的基因敲除。
同时，张锋团队通过分析SpCas9晶体结构，将这个DNA结合区域的一些正电荷氨基酸（Lys和Arg）突变成Ala后，筛选得到一些能够显著提高特异性的突变，并将升级版SpCas9命名为eSpCas9（1.0）和eSpCas9（1.1）。经过检测证明升级版SpCas9靶向切割DNA的突变效率也比较高。