纯化线粒体氧化应激活性氧（ROS）鲁米诺化学发光法定量检测试

纯化线粒体氧化应激活性氧鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒产品说明书
（中文版）

主要用途

纯化线粒体氧化应激活性氧（ROS）鲁米诺化学发光法定量检测试剂是一种旨在通过自由基探针鲁米诺和强化剂的参与下，线粒体样品中的活性氧族使发光物氧化降解并发光，在化学发光仪（Luminometer）的帮助下定量检测样品中活性氧族（过氧化氢）的生成和数量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种生物体线粒体组分的活性氧族的检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定，检测敏感。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。线粒体是真核细胞的膜性细胞器，是产生活性氧、进行氧化还原反应的重要场所。鲁米诺（luminol），又称氨基邻苯二甲酰肼（luminol；3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一种脂溶性的发光剂，氧化后生成鲁米诺自由基而化学发光，具有460nm左右峰值的带状光谱，肉眼可观察到鲜明的紫蓝色。鲁米诺以单价氧化形式与超氧自由基阴离子反应，产生不稳定性内过氧化物或二氧环丁烷（Dioxetane），由此分解成电激发状态，通过释放光子，回复到基态。鲁米诺作为探针，可以检测线粒体中过氧化氢、超氧自由基阴离子和羟自由基，其中过氧化氢最强，其发光强度与过氧化氢水平成正相关。

产品内容

清理液（Reagent A） 毫升
强化液（Reagent B） 毫升
发光液（Reagent C） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存强化液（Reagent B）和发光液（Reagent C）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
恒温水槽：用于样品孵育
微型台式离心机：用于去除样品杂质
测试管或黑色96孔板：用于发光检测用的容器
化学发光仪：用于检测化学发光

实验步骤

• 样品预处理

1. 移取100微升新鲜制备（2小时内）的纯化线粒体（400微克线粒体蛋白）到预冷的1.5毫升离心管，置于冰槽里
2. 加入xx微升清理液（Reagent A），轻轻混匀线粒体
3. 放进37℃恒温水槽孵育10分钟
4. 加入10微升用户自备的待测药品
5. 即刻进入下列测读操作

• 测读

测读开始前，打开化学发光仪，设定仪器内温度为37℃预热和整合测读10秒或 15分钟；然后关掉实验室的灯光。将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化，严格置于暗室里。然后进行下列操作。

1. 1. 准备好测试管，做好标记：阴性对照、样品本底和样品活性
   2. 移取xx微升清理液（Reagent A）到阴性对照测试管
   3. 移取400微升上述预处理的待测线粒体到样品本底测试管
   4. 移取400微升上述预处理的待测线粒体到样品活性测试管
   5. 分别加入xx微升强化液（Reagent B）到上述测试管，除样品本底测试管外
   6. 分别加入xx微升发光液（Reagent C）到上述测试管，除样品本底测试管外
   7. 轻轻涡旋混匀
   8. 即刻放进37℃化学发光仪里测读
   9. 整合测读10秒，获得相对发光单位（relative light unit；RLU）
   10. 或者整合测读15分钟，获得光电子读数：X 10⁶ CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液体闪烁仪替代）
   11. 计算ROS水平：

注意事项

1. 本产品为50次操作
2. 操作时，须戴手套
3. 测试前，线粒体分离后2小时内为最佳
4. 线粒体悬液须在4℃温度下保存备用
5. 如果测定体系变化，则试剂用量相应变化
6. 系统操作过程中，阴性对照只需测定一次
7. 测读的所有步骤均须在暗室里进行
8. 如果是注射式化学发光仪，建议测试前后使用无离子水冲洗化学发光仪注射（injector）管道
9. 本公司提供系列活性氧分析试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

上海羽哚生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。