软琼脂细胞克隆试剂盒

软琼脂细胞克隆试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

软琼脂细胞克隆试剂是一种旨在模拟活体内（in vivo）细胞外基质的半固体生长环境，进行活体外（in vitro）探测评价和定量分析细胞纯系化集落生长的潜力（colony-forming-unit）和生物学特性的常用细胞生长介质和权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其特别适用于动物或人体转化型体细胞和转染后细胞的生长。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，操作简便，重复一致。

技术背景

采用半固体介质模拟活体内细胞生长环境进行活体外检测是细胞形态学研究的基本手段。第一建立一个使细胞可以悬浮或立体生长的空间；第二便于观察细胞生长潜能和形态来判断细胞性质：肿瘤细胞、转化型体细胞或悬浮细胞；第三易于分离由单细胞生长而成的特征性纯系细胞群落。作为半固体介质之一的专用软琼脂（Agarose），其性能稳定，操作简便，常用于肿瘤细胞或转染后细胞的集落生长。在体外培养基中由一个祖先细胞增殖形成的细胞团，称之为集落。肿瘤细胞能无限繁殖，所以具有这种能力，而成熟分化的细胞则不能形成集落。这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

产品内容

克隆液（Reagent A） 毫升
高养液（Reagent B） 毫升
中养液（Reagent C） 毫升
低养液（Reagent D） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

克隆液（Reagent A）保存在室温下；其余的保存在4℃的冰箱里，有效保证6月

用户自备

完全细胞培养液：用于后续的克隆细胞收集培养
恒温水浴：用于预热和保温克隆培养液
50毫升锥形离心管：用于混匀克隆液的容器
15毫升锥形离心管：用于混匀细胞和克隆液的容器
涡旋震荡器：用于离心管内容物的震荡混匀
25cm²细胞培养瓶或12孔细胞培养板：用于细胞铺板培养
倒置显微镜：用于观察细胞的集落生长



实验步骤

实验开始前，将4℃冰箱里的试剂盒中的所有试剂溶液放进37℃恒温水浴里预热。然后进行下列操作。

• 细胞培养瓶（25cm²）操作

1. 将克隆液（Reagent A）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出）
2. 放进50℃恒温水浴
3. 移出xx毫升预热的高养液（Reagent B）到50毫升锥形离心管
4. 移出xx毫升克隆液（Reagent A）到50毫升锥形离心管
5. 轻度涡旋震荡或用手摇动锥形离心管，充分混匀
6. 最快速度分别移入3毫升（每个3毫升）到10个25cm²细胞培养瓶
7. 用手轻轻抖动，铺满整个底面，避免气泡产生
8. 置于室温下至少2小时，使胶体凝固
9. 准备1瓶25cm²或75cm²细胞培养瓶的待测细胞，清洗，脱落，计数
10. 移出1毫升（总量为2500个细胞）到15毫升锥形离心管
11. 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
12. 小心抽去上清液
13. 加入xx毫升预热的中养液（Reagent C），用枪头上下轻柔抽吸混匀（注意：用户可以加入细胞因子、筛选药物等）
14. 加入xx微升克隆液（Reagent A），用枪头上下轻柔抽吸混匀
15. 最快速度全部移入到1个25cm²细胞培养瓶里，置于已凝固的胶体上面
16. 用手轻轻抖动，铺满整个底面，避免气泡产生
17. 置于室温下至少2小时，使胶体凝固
18. 放进37℃二氧化碳细胞培养箱孵育
19. 次日，轻轻加入xx毫升低养液（Reagent D）在胶体上面（注意：用户可以加入细胞因子、筛选药物等）
20. 1周后，再次加入xx毫升低养液（Reagent D）在胶体上面
21. 2周后，在倒置显微镜下观察细胞：细胞集落形成能力和效率（Clonogenicity/Efficiency），包括细胞集落数目、细胞集落大小，以及贴壁非依赖型生长等
22. （选择步骤）小心抽去低养液（Reagent D）
23. （选择步骤）用细胞刮脱棒小心刮落含有细胞集落的中养层
24. （选择步骤）用1000微升枪头（翦去尖端部分）吸出细胞集落
25. （选择步骤）加入到25cm²细胞培养瓶
26. （选择步骤）加入3毫升用户自备的完全细胞培养液
27. （选择步骤）用5毫升移液管抽吸，充分打碎细胞集落
28. （选择步骤）放进37℃二氧化碳细胞培养箱继续孵育

二、细胞培养板（12孔板）操作

1. 将克隆液（Reagent A）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出）
2. 放进50℃恒温水浴
3. 移出xx毫升预热的高养液（Reagent B）到50毫升锥形离心管
4. 移出xx毫升克隆液（Reagent A）到50毫升锥形离心管
5. 轻度涡旋震荡或用手摇动锥形离心管，充分混匀
6. 最快速度分别移入1.5毫升（每孔1.5毫升）到12孔细胞培养板的每个孔里
7. 用手轻轻抖动，铺满整个底面，避免气泡产生
8. 置于室温下至少2小时，使胶体凝固
9. 准备1瓶25cm²或75cm²细胞培养瓶的待测细胞，清洗，脱落，计数
10. 移出1毫升（总量为2500个细胞）到15毫升锥形离心管
11. 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
12. 小心抽去上清液
13. 加入xx毫升预热的中养液（Reagent C），用枪头上下轻柔抽吸混匀（注意：用户可以加入细胞因子、筛选药物等）
14. 加入xx微升克隆液（Reagent A），用枪头上下轻柔抽吸混匀
15. 最快速度全部移入到12孔细胞培养板的1个孔里，置于已凝固的胶体上面
16. 用手轻轻抖动，铺满整个底面，避免气泡产生
17. 置于室温下至少2小时，使胶体凝固
18. 放进37℃二氧化碳细胞培养箱孵育
19. 次日，轻轻加入xx微升低养液（Reagent D）在胶体上面（注意：用户可以加入细胞因子、筛选药物等）
20. 1周后，再次加入xx微升低养液（Reagent D）在胶体上面
21. 2周后，在倒置显微镜下观察细胞：细胞集落形成能力和效率（Clonogenicity/Efficiency），包括细胞集落数目、细胞集落大小，以及贴壁非依赖型生长等
22. （选择步骤）小心抽去低养液（Reagent D）
23. （选择步骤）用细胞刮脱棒小心刮落含有细胞集落的中养层
24. （选择步骤）用1000微升枪头（翦去尖端部分）吸出细胞集落
25. （选择步骤）加入到25cm²细胞培养瓶或6孔细胞培养板的1个孔里
26. （选择步骤）加入3毫升用户自备的完全细胞培养液
27. （选择步骤）用5毫升移液管抽吸，充分打碎细胞集落
28. （选择步骤）放进37℃二氧化碳细胞培养箱继续孵育

注意事项

1. 本产品为10次（25cm²细胞培养瓶）或20次（12孔细胞培养板）操作
2. 其它实际操作的细胞培养瓶或细胞培养皿大小与试剂使用量按比例调整
3. 所有培养操作和使用工具均须在严格无菌状态下进行
4. 克隆液（Reagent A）拧松瓶盖，微波炉加热，注意低功率和短时操作，密切关注，否则会过度加热而干枯。也可以使用高压蒸汽替代
5. 建议使用细胞培养瓶，可以拧紧瓶盖，确保长期培养，以免干枯
6. 细胞克隆培养的最佳细胞量一般为2500细胞数，也可以根据用户的细胞类型确定；如果测试新的细胞类型，可以试验2500、5000、10000、和25000细胞数，从而确定最佳细胞量
7. 已经铺板但暂时保存的含凝胶体的培养瓶或培养皿，用PARAFILM密封，在4℃冰箱里储存
8. 操作时小心轻柔，避免胶体脱位
9. 如果用户需要增加细胞生长因子或选择性筛选药物，可以加入到中养液（Reagent C）里
10. 如果用户需要增加选择性筛选药物，可以咨询本公司技术部
11. 通常10至14天肉眼可见细胞集落形成
12. 注意观察胶体上面的低养液（Reagent D）情况，必要时随时加入，以防干枯
13. 建议用户使用细胞特定培养液替代低养液（Reagent D），以利细胞集落形成
14. 如果需要收集克隆细胞，可以使用细胞刮脱棒小心刮落中养层
15. 本公司同时提供甲基纤维素细胞克隆试剂盒（YD10003）
16. 本公司提供系列细胞培养和筛选试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定无病毒和支原体污染
3. 本产品经鉴定重复率100％

使用承诺

上海羽哚生物着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。