动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒

动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂是一种旨在从动物细胞或组织中分离出活性完整而高度纯化的线粒体细胞器的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。适合于动物软组织（肝或脑组织）和培养细胞的活性线粒体的制备。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。可以被用于线粒体酶活性、细胞凋亡、信号传递、能量代谢、蛋白组学和病理生理学等的研究。产品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度堪称同类产品最佳。

技术背景

线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。

产品内容

清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
净化液（Reagent C） 毫升
强化液（Reagent D） 毫升
保存液（Reagent E） 毫升
活性液（Reagent F） 微升
高纯液（Reagent G） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存净化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；高纯液（Reagent G），避免光照；裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）严格无菌操作；有效保证6月

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液（GMS12028）或PBS缓冲溶液（GMS12033）：用于清理细胞
硬组织处理液（Reagent G）：用于促进硬组织表面溶解
胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的细胞培养基
15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放
50毫升锥形离心管：用于细胞或组织收集后离心或清洗
1.5毫升离心管：用于保存线粒体
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
4℃超速离心机：用于分离细胞器成分和高质纯化
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

实验步骤

一、动物软组织线粒体分离（组织匀浆法）

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent F）、 xx 净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

1. 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时）
2. （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3. （选择步骤）加入适量的（1克组织需要xx毫升）清理液（Reagent A）清洗1次
4. 即刻用刀片切碎组织
5. 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6. 加入预冷的xx毫升裂解工作液
7. 涡旋震荡5秒，充分混匀
8. 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
9. 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）（注意：参见注意事项6）
10. 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
11. 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
12. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
13. 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
14. 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
15. 加入xx微升保存液（Reagent E），充分混匀沉淀颗粒
16. 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
17. 移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent G)）
18. 轻轻加入xx微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
19. 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
20. 小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
21. 小心抽去线粒体样品带以上的液体
22. 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品
23. 加入xx至xx毫升保存液（Reagent E）
24. 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
25. 小心抽去上清液
26. （选择步骤）重复实验步骤23至25一次
27. 加入xx微升保存液（Reagent E），混匀
28. 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
29. 放进－70℃冰箱里保存

二、动物软组织线粒体分离（化学处理法）

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent F）、 xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

1. 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时）
2. （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3. （选择步骤）加入适量的（1克组织需要xx毫升）清理液（Reagent A）清洗1次
4. 移入一个液氮冻存管
5. 即刻放入液氮罐过夜
6. 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
7. 放进一个15毫升锥形离心管
8. 加入预冷的xx毫升裂解工作液
9. 涡旋震荡5秒，充分混匀
10. 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
11. 加入预冷的xx微升强化液（Reagent D）
12. 涡旋震荡5秒，充分混匀
13. 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项7）
14. 加入预冷的xx毫升保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
15. 放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
16. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
17. 放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
18. 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
19. 加入xx微升保存液（Reagent E），充分混匀沉淀颗粒
20. 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
21. 移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent G)）
22. 轻轻加入xx微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
23. 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
24. 小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
25. 小心抽去线粒体样品带以上的液体
26. 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品
27. 加入xx至xx毫升保存液（Reagent E）
28. 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
29. 小心抽去上清液
30. （选择步骤）重复实验步骤27至29一次
31. 加入xx微升保存液（Reagent E），混匀
32. 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
33. 放进－70℃冰箱里保存

三、动物细胞线粒体分离（细胞匀浆法）

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent F）、 xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

1. 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（5 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面
2. 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
3. 重复实验步骤2一次
4. 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液，铺满整个培养平面
5. 置入37℃培养箱3分种
6. 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
7. 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
8. 移入一个50毫升锥形离心管
9. 放入台式离心机离心10分钟，速度为200g
10. 小心抽去上清液
11. 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞
12. 放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
13. 小心抽去上清液
14. 加入预冷的xx毫升裂解工作液
15. 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
16. 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
17. 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项6）
18. 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
19. 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
20. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
21. 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
22. 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
23. 加入xx微升保存液（Reagent E），充分混匀沉淀颗粒
24. 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
25. 移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent G)）
26. 轻轻加入xx微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
27. 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
28. 小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
29. 小心抽去线粒体样品带以上的液体
30. 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品带
31. 加入xx至xx毫升保存液（Reagent E）
32. 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
33. 小心抽去上清液
34. （选择步骤）重复实验步骤31至33一次
35. 加入xx微升保存液（Reagent E），混匀
36. 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
37. 放进－70℃冰箱里保存

四、动物细胞线粒体分离（化学处理法）

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent F）、 xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

1. 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（5 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面
2. 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
3. 重复实验步骤2一次
4. 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液，铺满整个培养平面
5. 置入37℃培养箱3分种
6. 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
7. 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
8. 移入一个50毫升锥形离心管
9. 放入台式离心机离心10分钟，速度为200g
10. 小心抽去上清液
11. 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A）
12. 放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
13. 小心抽去上清液
14. 加入预冷的xx毫升裂解工作液
15. 涡旋震荡5秒，充分混匀
16. 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
17. 加入预冷的xx微升强化液（Reagent D）
18. 涡旋震荡5秒，充分混匀
19. 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项7）
20. 加入预冷的xx毫升保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
21. 放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
22. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
23. 放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
24. 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
25. 加入xx微升保存液（Reagent E），充分混匀沉淀颗粒
26. 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
27. 移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀高纯液(Reagent G)）
28. 轻轻加入xx微升线粒体混匀液在高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
29. 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
30. 小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
31. 小心抽去线粒体样品带以上的液体
32. 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品带
33. 加入xx至xx毫升保存液（Reagent E）
34. 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
35. 小心抽去上清液
36. （选择步骤）重复实验步骤33至35一次
37. 加入xx微升保存液（Reagent E），混匀
38. 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
39. 放进－70℃冰箱里保存

注意事项

1. 本产品为10次操作（1克动物组织或5 X 10⁷细胞）
2. 所有操作均须在4℃或以下状态进行
3. 操作时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
4. 建议使用足够的组织或细胞量
5. 建议严格控制操作时间
6. 通常匀化次数为20至40下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
7. 通常孵育5分钟（不宜超过5分钟）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
8. 对于难以裂解的细胞，例如HeLa细胞等，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理
9. 建议使用40000g以上离心速度；如果没有条件，则不能低于30000g，离心时间增加为60至90分钟
10. 通常1克动物组织或5 X 10⁷细胞的线粒体含量为50微克以上线粒体蛋白
11. 如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
12. 本产品所获得的线粒体纯度（可达到99％）和产量最为理想
13. 使用高纯液（Reagent G）前，须摇匀后加入；并注意避免污染母液
14. 根据超速离心管的大小调整高纯液（Reagent G）的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
15. 线粒体正常活性测定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
16. 线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色
17. 本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
18. 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整
3. 本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性
4. 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶
5. 本产品经鉴定分离的线粒体纯度达99％

使用承诺

上海羽哚生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。