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Reactive Oxygen Species Assay Kit
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翌圣生物科技(上海)股份有限公司
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1 Kit (1000 tests)
产品信息
产品名称 |
产品编号 |
规格 |
价格 |
Reactive Oxygen Species Assay Kit 活性氧(ROS)检测试剂盒 |
50101ES01 |
1 Kit (1000 tests) |
965 |
检测原理
产品组分
编号 |
组分 |
规格 |
保存方法 |
50101-A |
DCFH-DA (10 mM) |
0.1 mL |
-20℃ |
50101-B |
活性氧阳性对照(Rosup, 100 mM) |
1.0 mL |
-20℃ |
运输与保存
冰袋运输。-20℃干燥保存,避免强光直射。有效期一年。
操作过程
1.装载探针
1.1原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
1)细胞准备:检测前一天进行细胞铺板,确保检测时细胞汇合度达到50~70%。
【注】:必须保证细胞状态健康,且检测时不会过度生长。
2)药物诱导:去除细胞培养液,加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物,于37℃细胞培养箱内避光孵育,具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。
(可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM,加入细胞,一般37℃避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。【如HeLa细胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h】
3)探针准备:探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。
4)探针装载:吸除诱导用药物,加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。例如,对于6孔板通常不少于1000 μL,对于96孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。
5)细胞清洗:用无血清培养液洗涤细胞1~2次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
1.2 收集细胞后装载探针:适用于贴壁细胞和悬浮细胞。
1)细胞准备:按照标准方法培养细胞,必须保证检测用细胞状态健康。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞。
2)药物诱导:将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物,于37℃细胞培养箱内避光孵育,具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。
(可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM,加入细胞,一般37℃避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。【如HeLa细胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h】
3)探针准备:探针装载前,按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。
4)探针装载:去除细胞内药物,离心收集细胞,加入适当稀释好的探针,使其细胞密度为1.0×106~2.0×107。【注】:细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法,以及检测总量来进行调整。如对于流式分析,单管检测内细胞数目不少于104,也不可多于106。每隔3-5 min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。
5)细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2.检测
原位装载探针法:激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
收集细胞后装载探针:用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。
3.参数设置
使用488 nm激发波长,525 nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。
其他事项说明
1)对于刺激时间较短(通常2 h以内)的细胞,也可先装载探针,后用活性氧阳性对照和/或感兴趣药物刺激细胞,如阳性对照刺激,应先加入适量探针于37℃避光孵育30 min;然后再加入等体积2×阳性对照Rosup溶液(200 μM),37℃避光诱导30 min-4 h;
2)阳性对照Rosup通常浓度为100 μM。通常刺激后30 min-4 h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞,活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 min内观察不到活性氧的升高,可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快,可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
3)对于某些细胞,如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可以按照1: 2000~1: 5000稀释DCFH-DA,使装载探针时DCFH-DA的浓度为2~5 μM。探针装载的时间也可以根据情况在15~60 min内适当进行调整。
4)活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品,并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
注意事项
1)探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
2)探针装载完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的装载情况是否良好。
3)尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差。
4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
5)本产品仅作科研用途!
客户使用本产品发表的科研文献(部分)
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