Bsu DNA 聚合酶，大片段 Bst DNA Polymerase，Large Fragment

Bsu DNA 聚合酶，大片段 Bst DNA Polyme

rase，Large Fragment
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      Bst DNA Polymerase，Large Fragment

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    ♦ 随机引物法标记
    ♦ 合成 cDNA 第二链
    ♦ 单个 dA 的加尾
    ♦ 链置换的 DNA 合成（2）
    概述
    Bsu DNA 聚合酶大片段保留了Bacillus subtilis DNA 聚合酶 I 的 5' →3' 聚合酶活性（1），但是缺失了 5' →3' 外切酶结构域。大片段缺乏 3' →5' 外切酶活性。
    来源
    重组的E. coli菌株，携带有Bacillus subtilis DNA聚合酶 I 基因（起始于第 297 个密码子，因而缺失了5' →3' 外切酶结构域）和麦芽糖结合蛋白（MBP）基因，两个基因融合表达，提纯融合蛋白后，在体外切除 MBP 部分。剩下的 DNA 聚合酶经纯化后不含 MBP。
    反应缓冲液
    1X NEBuffer 2 [50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT （pH 7.9 @ 25 ℃）]。加入 33 μM dNTPs（不随酶提供）。
    单位定义
    1 单位指 37 ℃条件下，30 分钟内使 10 nmol的 dNTP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。
    活性检测条件
    1X NEBuffer 2 中加入 33 μM dNTP（包括 [3H]-dTTP）和 70 μg/ml 的变性鲑鱼精 DNA。37 ℃温育。
    浓度
    5,000 units/ml。
    贮存条件
    25 mM Tris-HCl（pH 7.4），50 mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT 和 50% 甘油。
    热失活
    75 ℃ 20 分钟。
    使用注意事项
    由于缺乏 3' →5' 外切酶活性，BsuDNA 聚合酶大片段不能切除 3' 未配对的突出末端，因而不适用于平滑末端。
    添加 dNTP 后，Bsu DNA 聚合酶大片段在所有的 NEB限制性内切酶反应混合液中均有活性。
    25 ℃时 Bsu DNA 聚合酶大片段保留 50% 的活性，是同温度下 Klenow 片段（3' →5' exo–）的两倍。
    参考文献
    (1) Okazaki, T. et al. (1964) J. Biol. Chem. 239, 259–268.
    (2) Piepenburg, O. et al. (2006) PLOS Biology, 4, 1115–1121.

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