原位杂交（DAB）服务

一、服务简介

实验原理

二、完整标准实验流程

1. 组织固定：新鲜组织清洗后立即放入 DEPC 水配制的固定液中固定 2–12h。
2. 脱水包埋：组织梯度酒精脱水、浸蜡后进行石蜡包埋。
3. 烤片制备：石蜡切片机切片，摊片机捞片，62℃烤箱烤片 2h。
4. 切片脱蜡水化：二甲苯 Ⅰ15min→二甲苯 Ⅱ15min→无水乙醇 Ⅰ5min→无水乙醇 Ⅱ5min→85% 酒精 5min→75% 酒精 5min→DEPC 水洗。
5. 组织消化：切片置于修复液煮沸 10–15min，自然冷却；组化笔画圈，滴加 20ug/ml 蛋白酶 K，37℃消化 20–30min；纯水冲洗，PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
6. 内源酶阻断：滴加 3% 甲醇 - H₂O₂，室温避光孵育 15min；PH7.4 PBS 摇洗 3 次，每次 5min。
7. 预杂交：滴加预杂交液，37℃孵育 1h。
8. 探针杂交：弃预杂交液，滴加含探针杂交液，37℃恒温杂交过夜。
9. 杂交后洗涤：2×SSC 37℃洗 10min；1×SSC 37℃洗涤 2 次，每次 5min；0.5×SSC 室温洗 10min；非特异性杂交信号较多时可增加甲酰胺洗涤步骤。
10. 封闭处理：滴加正常兔血清封闭液，室温孵育 30min。
11. 一抗孵育：弃封闭液，滴加鼠抗地髙辛过氧化物酶抗体 anti-DIG-HRP，37℃孵育 40min，PBS 洗涤 4 次，每次 5min。
12. DAB 显色：甩干切片，滴加新鲜配制 DAB 显色液，显微镜下把控显色时长，纯水冲洗终止显色，阳性信号呈棕黄色。
13. 细胞核复染：Harris 苏木素染核约 3min，自来水冲洗；1% 盐酸酒精分化数秒，水洗，安水返蓝后流水冲洗。
14. 脱水透明封片：75% 酒精 6min→85% 酒精 6min→无水乙醇 Ⅰ6min→无水乙醇 Ⅱ6min→正丁醇 6min→二甲苯透明；切片晾干后中性树胶封片。
15. 镜检成像：光学显微镜观察并采集图像。

三、结果判读标准

四、样本送样与运输规范

1. 新鲜组织：可干冰运输制备冰冻切片；或取厚度约 2mm 组织，5 分钟内放入原位杂交固定液，4℃保存运输，禁止冷冻结冰；固定时间过长会降低核酸检出效率，需尽快包埋切片。
2. 冰冻切片：-20℃条件保存、运输。
3. 石蜡切片：常温保存、运输。
4. 细胞爬片：原位杂交固定液固定 15min，更换无酶 PBS 密封，4℃运输。

五、送检单据填写要求

1. 如需合成探针：提供目的基因序列或基因登录号、探针标记类型；
2. 自带探针送检：完整标注探针相关信息；
3. 清晰写明全部检测需求。

六、交付成果