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        免疫组织化学(HRP-DAB系统)

        互联网

        17215

        1. 溶液准备:

        PBS ( pH7.4 ) :10mM Na2HPO4 ,1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl

        封闭缓冲液:3%BSA-PBS

        2. 程序:

        1 ) 对石蜡切片进行脱蜡和水化:3×10min 二甲苯,5min 100%乙醇,5min 95%乙醇,5min 80%乙醇, 5min 70%乙醇,3×5min PBS。

        2 ) 修复抗原,PBS洗涤三次,每次5min。

        3 ) 室温下,将玻片在3%H2O2-甲醇溶液中浸泡15min封闭内源性过氧化物酶,然后用PBS洗涤三次,每次 5min。

        4 ) 加入一抗(用3%BSA-PBS封闭液1:50稀释一抗),37℃湿盒孵育1h。

        5 ) 加入Post-blocking室温湿盒孵育30min,然后用PBS洗涤三次,每次5min。

        6 ) 加入稀释好的辣根过氧化物酶(HRP)标二抗,室温下湿盒孵育30min。

        7 ) 用PBS洗涤玻片5次,每次5min。

        8 ) 按照DAB试剂盒说明添加显色液,避光显色30s-5min。用蒸馏水终止显色反应。

        9 ) 苏木精进行复染色3min,用蒸馏水冲洗。

        10 ) 立即进行脱水和透明:1×5min 70%乙醇,1×5min 80%乙醇,1×5min 90%乙醇,1×5min100%乙醇,2×10min二甲苯。

        11 ) 中性树胶封片。

        3. 抗原修复方法:

        ① 柠檬酸钠法:

        (a) 把玻片放在玻璃固定架上,再将架子放在盛有600ml的10mM柠檬酸钠(pH6.0)的容器中。

        (b) 微波中高火6-8min。

        (c) 室温冷却。

        (d) 用PBS洗涤3次,每次5min。

        ② 蛋白酶K法:

        (a) 配制新鲜溶液:

        25μl 20mg/ml蛋白酶K

        2.5ml 1MTris-HCl(pH8.0)

        0.5ml 0.5M EDTA(pH8.0) 加水定容到50ml

        (b) 37℃下,将玻片放在架子上孵育5min(蛋白酶K不要预热)。

        (c) 用PBS洗涤3次,每次5min.

        ③ 尿素法:

        (a) 把玻片放在玻璃固定架上,再将架子放在盛有600ml 的1M尿素(新鲜配制)的容器中。

        (b) 微波10min,20min或者30min,每5min补充一次蒸发掉的水。

        (c) 冷却30min到1h。

        (d) 用蒸馏水洗涤4次,每次3min,再用PBS洗涤3min。

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