TaqMan探针法 实时荧光定量PCR | 检测基因表达

1. 技术原理

TaqMan探针法，也称为水解探针法，是一种特异性极高的实时荧光定量PCR技术。其核心原理依赖于一个额外的、序列特异性的寡核苷酸探针，该探针在PCR过程中被水解，从而释放出荧光信号。该技术基于荧光共振能量转移 原理，其关键组件包括：

1. TaqMan探针：一条与靶序列内部区域特异性结合的寡核苷酸探针，其两端分别标记有：

   • 报告荧光基团：位于5‘端（如FAM， VIC）。

   • 淬灭荧光基团：位于3’端（如TAMRA， BHQ）。当两个基团距离很近时，报告基团发出的荧光会被淬灭基团吸收，导致检测不到荧光信号。

2. PCR扩增与信号产生：

   • 在PCR的退火/延伸阶段，当引物与模板结合后，TaqMan探针会特异性地杂交到其互补的靶序列上。

   • Taq DNA聚合酶在延伸引物链时，会发挥其 5‘ → 3’ 外切核酸酶活性，将结合在模板上的探针逐一切割、水解。

   • 探针被水解后，报告基团与淬灭基团物理分离，FRET效应被解除。报告基团随后在激光激发下产生可检测的荧光信号。

   • 每水解一条探针，就释放一个荧光信号分子。因此，荧光的累积量与PCR产物的累积量成正比。

通过实时监测每个循环的荧光强度，即可精确计算出起始模板的量。

2. 实验流程

1. 实验设计

   • 引物与探针设计：设计一对特异性引物和一条位于引物之间的TaqMan探针。探针的Tm值通常比引物高5-10°C，以确保其在退火时能优先结合。

   • 探针标记：选择报告基团和淬灭基团进行标记。现代探针常使用非荧光淬灭基团以降低本底。

2. 反应体系配制

   • 将模板DNA/cDNA、特异性引物、TaqMan探针、以及包含Taq酶（具有5‘→3’外切酶活性）的qPCR预混液混合。

3. 实时荧光PCR运行

   • 将反应管放入实时荧光定量PCR仪，设置标准的三步法循环程序：

     • 预变性：95°C， 2-5分钟。

     • 循环扩增（40-45个循环）：

       • 变性：95°C， 15秒。

       • 退火/延伸：60°C， 30-60秒（在此阶段采集荧光信号）。

4. 数据分析

   • 与SYBR Green法类似，通过Ct值进行定量分析。

   • 对于绝对定量，通过已知拷贝数的标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算未知样品的起始拷贝数。

   • 对于相对定量（如基因表达分析），同样使用比较Ct法，用内参基因（通常也使用TaqMan探针检测）对目标基因进行标准化。

3. 技术应用

• 基因表达分析：精确定量mRNA表达水平，是转录组研究的金标准之一。

• 病原体检测与绝对定量：广泛应用于临床诊断，如病毒（HIV， HBV， HCV， SARS-CoV-2）和细菌的载量检测，可给出精确的拷贝数/mL。

• 基因分型：通过等位基因特异性TaqMan探针（如标记不同报告基团），可以对SNP进行快速、高通量的分型。

• 转基因检测与拷贝数变异分析：精确测定转基因的拷贝数或基因组中特定区域的拷贝数变异。

• microRNA表达分析：使用特殊的茎环结构引物进行逆转录，结合TaqMan探针，可对微小的miRNA进行高特异性定量。

5. 技术优势

• 极高的特异性：由于信号产生依赖于探针与模板的特异性结合和水解，有效避免了引物二聚体或非特异性扩增产物带来的假阳性信号。

• 适合多重PCR：可以在同一反应管内使用标记了不同颜色报告基团的探针，同时检测多个（通常2-4个）靶标，大大提高了通量和效率。

• 无需熔解曲线分析：因为特异性由探针保证，反应结束后通常不需要进行熔解曲线分析，简化了实验步骤和数据分析。

• 定量准确度高：背景荧光低，信噪比高，使其在绝对定量方面表现尤为出色。