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- Real-Time PCR
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- 2026年01月14日
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- 提供商：
武汉恒意赛生物
- 服务名称：
Real-Time PCR
- 规格：
PCS
实时定量PCR/Co-IP/ChIP服务
实时荧光定量PCR是在Life technologies公司的StepOne™ Real-Time PCR仪上完成，每个样品均作3个复孔，使用EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix试剂盒进行（ELK Biotechnology,EQ001）：
（1）反应程序为：预变性 95℃，3min
循环（40次） 95℃，10s→58℃，30s→72℃，30s
熔解曲线 仪器默认设置
（2）反应体系为：
| 试剂 | 使用量 |
| 2×Master Mix | 5.0 μL |
| 引物工作液（2.5μM） | 1.0 μL |
| Template | 1.0 μL |
| ddH2O | 2.0 μL |
| Rox | 1.0 μL |
（3）、附录
1、数据分析方法
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，实验样本)- CT(内标基因，实验样本)
B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)
K=A-B
表达倍数=2-K
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文献和实验随机引物 适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA 的反转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反应。 Oligo dT 适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA。（原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具PolyA 尾 巴。）由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长 cDNA 合成量大大减少。 基因特异性引物 与模板序列互补
定量RT-PCR （Quantitative RT-PCR）
A = B(1+e) n A=amplified products, B=input templates, n=cycle number, and e=amplification efficiency. Factors affecting amplification efficiency in the RT-PCR process include the efficiency of reverse
性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A.变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA； B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C.延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2＋存在下，退火引物沿 5‘ —— 3’ 方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3. 逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性： (1)依赖 RNA
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