SYBR Green染料法RT-qPCR检测基因表达

1. 技术简介

RT-qPCR 是 逆转录-实时定量聚合酶链式反应 的缩写。它包含两个连续的过程：

1. 逆转录：以RNA（通常是总RNA或mRNA）为模板，通过逆转录酶合成互补的cDNA。

2. 实时定量PCR：以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，对目标基因进行扩增和检测。

       SYBR Green染料法 是qPCR阶段最常用的检测方法之一。其核心原理在于：SYBR Green I是一种能特异性地嵌入双链DNA小沟中的荧光染料。它本身在游离状态下荧光微弱，但一旦与双链DNA结合后，其荧光信号会呈数百倍地增强。在qPCR的每个循环的延伸结束时，所有新合成的双链DNA产物都会被SYBR Green染料结合，并产生荧光信号。模板的起始拷贝数越高，扩增产物积累得越快，荧光信号达到设定阈值所需的循环数就越早。通过监测整个反应过程中荧光信号的变化，系统可以绘制出实时的扩增曲线，并据此对起始模板进行精确定量。

2. 实验流程

1. RNA提取与质量评估

   • 从细胞或组织中提取高质量、无降解的总RNA。

   • 使用微量分光光度计检测RNA的浓度和纯度（A260/A280比值应在1.8-2.0之间，A260/A230 > 2.0）。

   • 通过琼脂糖凝胶电泳或安捷伦生物分析仪确认RNA的完整性。

2. 逆转录

   • 使用逆转录酶、引物（随机引物、Oligo dT或基因特异性引物）和dNTPs，将等量的RNA（通常为0.5μg - 1μg）反转录为第一链cDNA。

   • 此步获得的cDNA可作为后续qPCR的模板。

3. 实时定量PCR

   • 反应体系配制：将cDNA模板、SYBR Green qPCR预混液（包含热启动酶、dNTPs、缓冲液和SYBR Green染料）、以及针对目标基因的特异性引物混合。

   • 引物设计：这是实验成功的关键。引物需具有高特异性，通常长度为18-25 bp，退火温度在60°C左右，扩增子长度在80-200 bp为宜，以确保扩增效率。

   • 上机运行：将反应管放入实时荧光定量PCR仪，设置反应程序：

     • 预变性：95°C， 2-5分钟（激活热启动酶）

     • 循环反应（40-45个循环）：

       • 变性：95°C， 10-15秒

       • 退火/延伸：60°C左右， 30-60秒（在此阶段采集荧光信号）

   • 熔解曲线分析：在PCR循环结束后，进行熔解曲线分析。程序通常为：从60°C缓慢升温至95°C，并持续监测荧光信号的变化。

4. 数据分析方法

RT-qPCR的定量通常使用比较Ct法（又称2^–ΔΔCt法）。

1. Ct值：指每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。Ct值与起始模板量的对数成反比。

2. 内参基因：为了校正样品间cDNA加样量的差异和RNA质量的变化，必须使用在不同处理组间稳定表达的内参基因（如GAPDH， β-actin， 18S rRNA等）进行标准化。

3. 计算步骤：

   • ΔCt = 目标基因的Ct值 - 内参基因的Ct值

   • ΔΔCt = 实验组的ΔCt - 对照组的ΔCt

   • 相对表达量 = 2^(–ΔΔCt)

   • 最终结果表示实验组中目标基因相对于对照组的表达变化倍数。

4. 技术应用

• 基因表达水平分析：比较不同组织、不同发育阶段、不同处理（如药物、激素、应激）下特定基因的mRNA表达差异。

• microRNA表达分析：通过特殊的茎环引物进行逆转录，可以检测微小的miRNA。

• 病原体检测与定量：如病毒载量的检测（例如SARS-CoV-2的检测）。

• 转基因拷贝数确定。

• 药物疗效评估。

5. 技术优势

• 成本较低：相对于TaqMan探针法，SYBR Green染料法无需合成昂贵的特异性探针。

• 操作简便：只需设计特异性引物，实验设计和优化相对简单。

• 通用性强：同一款预混液可用于不同基因的检测，只需更换引物即可。

• 提供熔解曲线进行质控：可鉴别特异性扩增产物与非特异性扩增（如引物二聚体）。