阳性克隆

1. 基本定义

阳性克隆指含有目标重组DNA或特定蛋白的细胞/噬菌体克隆。例如：

• 基因工程中，携带外源目的基因的克隆称为阳性克隆子（期望重组子）。
• 抗体开发中，能分泌目标抗体的杂交瘤细胞或重组噬菌体即为阳性克隆。

2. 鉴定方法与标准

不同实验采用特异性检测手段：

• 分子检测：
  • PCR/酶切验证：克隆中扩增出目标片段（如1700bp的插入片段）或酶切后出现预期条带。
  • 测序确认：通过序列比对确认外源基因正确插入。
• 蛋白结合活性检测：
  • ELISA筛选：以P/N值（阳性/阴性OD450比值）>2.1为标准，或OD450值大于对照2倍。例如，抗PD-1抗体筛选要求OD450值 > Sp2/0细胞上清的2倍；抗Bt Cry1C抗体的阳性克隆P/N值需>2.1。
  • 噬菌体展示技术：通过多轮"panning"富集高亲和力克隆，每轮富集倍数达10²–10³。
    
     

3. 阳性克隆率的影响因素

• 载体与感受态细胞：载体量为200ng、使用Stbl3感受态细胞时，阳性克隆率最高达75%。
• 技术平台差异：
  • ZooMAb®重组抗体平台阳性克隆率80-90%，远高于杂交瘤技术（<1%）。
  • 噬菌体文库筛选的阳性率随抗原浓度升高而增加（0.5μg抗原时阳性率达58.3%）。

4. 筛选流程优化

• 基因编辑（CRISPR/Cas9）：
  • 混合克隆预筛（Pool验证）可快速评估突变效率。
  • Cruiser™酶可在20分钟内精准切割突变位点，通过电泳直观鉴定阳性克隆。
• 单克隆扩增：采用有限稀释法确保单细胞来源，经3-5轮亚克隆获得稳定株系。