16S测序（16S rDNA测序）#16S rRNA基因测序

16S测序原理：
16S测序是对样本提取总DNA接着进行目的片段区域(即16S rDNA的部分区域)扩增、测序，再通过数据分析从而得知样品中的微生物群落多样性。



16S rDNA是由10个保守区及9个可变区组成的，通过保守区序列我们可以判断物种间的亲缘关系，而通过可变区序列我们可以得知物种间的差异情况。
针对16S测序，目前市面上采用的测序平台主要有二代测序平台lluminaMiseq/Hiseq和三代测序平台。二代测序平台由于有读长限制，所以对16S的测序只能选择单v区、双v区或者三v区为目的片段区域，而又由于V3、V4、V5的特异性较好，数据库信息也比较全，所以我们在进行二代测序时常常选择V3V4、V4或者V4V5进行细菌多样性注释。其中V3V4区选用引物341F和806R，该引物在细菌和古菌的覆盖率均较高，我们可以利用它同时检测细菌和古菌的多样性分布。相对于二代测序的读长限制，三代测序平台对16S可进行全长测序，序列比对率和鉴定准确率都较二代测序更高。

16S测序工作流程：



16S测序实验流程：

实验这部分首先是样品生物学重复数量的设置问题，原则上是重复数量越多实验结果的准确率越高，通常建议5个以上，宿体环境如人类肠道、粪便等建议10个以上，但现实情况往往是科研经费有限不得不把生物学重复数量设得低—些，不过无论如何，为了保证实验的可信度，生物学重复数量原则上不得低于3个。
其次是样品的采集及运送、提取注意事项，这个过程千万马虎不得，所得的DNA质量高低直接决定了测序结果的准确性。由于核酸在室温下易发生变性讲解的情况，所以该过程一定要保证快速、低温的环境。

16S测序分析流程：
首先是将测序数据过滤、质控，过滤掉低质量的序列，保留clean data进行后续分析。接着进行OTU分析、注释，这个步骤中主要是将序列分成不同的分类单元，往往是按照97%的相似性进行OTU聚类。不过，新出现的Feature分析相当于100%相似性的OTU聚类，有替代OTU聚类的趋势。Feature的本质依旧是将序列分类成不同的可操作单元。也有不少同学感到困惑，为什么不直接对序列进行物种注释及后续分析呢?没错，原则上可以这么做，但测序序列少则几万，多则几千万，若对每条序列都注释的话则工作量太大了。先将序列分类成不同的可操作单元，可以大大提高效率，且在聚类的过程中会去除嵌合体等错误序列，从而提高分析的准确度。
将序列分成不同的可操作单元后，则可以进行后续分析，包括Alpha多样性分析、Beta多样性分析、微生物群落展示、组间物种差异分析、组间群落差异分析、环境因子分析、功能预测等。
 

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