条件性基因敲除

一、技术原理与核心系统

1. Cre-loxP系统

   • 起源与机制：源自P1噬菌体，由Cre重组酶和34bp的loxP位点组成。Cre酶识别loxP方向并介导DNA重组，根据loxP排列实现基因删除、反转或易位。
   • 时空特异性控制：
     • 组织特异性：将Cre基因连接至特定启动子（如心肌细胞αMyHC启动子），实现靶向器官敲除。
     • 时间诱导：
       • CreERT系统：Cre与突变雌激素受体（ERT）融合，注射他莫昔芬（Tamoxifen）后激活重组功能。
       • Tet-on/off系统：通过强力霉素（DOX）调控rtTA转录因子，控制Cre表达。

2. 替代重组系统

   • Flp-FRT/Dre-Rox系统：作用类似Cre-loxP，但重组效率较低，应用较少。

二、条件性基因敲除小鼠的构建流程

1. 基础步骤：

   • Step 1：构建"Flox小鼠"——在目标基因关键外显子两侧插入同向loxP序列。
   • Step 2：选择表达Cre的工具鼠（组织特异性或诱导型）。
   • Step 3：杂交繁育，获得Flox/Cre双阳性小鼠，Cre表达时靶基因被切除。

2. 诱导方法示例：

   • Tamoxifen诱导：75–100 mg/kg腹腔注射，连续5天（溶解于玉米油或葵花籽油）。
   • DOX诱导：通过饮水或饲料给予强力霉素，激活Tet系统。

三、核心应用场景

1. 解决传统敲除局限性：

   • 避免胚胎致死（如抑癌基因PTEN全身敲除致胚胎死亡）。
   • 研究基因在特定发育阶段或组织中的功能（如神经元、肠道上皮）。

2. 疾病机制研究：

   • 肾病模型：髓系特异性核因子ⅠB敲除揭示肠道炎症机制。
   • 肿瘤学：Pten条件敲除小鼠模拟前列腺癌、胶质瘤等发病过程。
   • 神经科学：PDGFB基因在Tamoxifen诱导后影响皮质神经元功能。

3. 药物研发：

   • 他莫昔芬对肠道菌群的影响评估。
   • 靶向基因编辑验证抗癌药物敏感性。