人类全基因组ORF表达文库/文库构建

云舟生物拥有全面的人类全基因组开放阅读框（ORF）资源，可提供满足多样化过表达筛选需求的ORF文库构建与筛选服务。我们每个单独的ORF克隆均经过全序列验证，可用于快速构建个性化的筛选文库。我们的ORF文库支持使用任何类型的载体骨架，可采用混合文库或阵列文库的方式构建，并以高性价比的方式交付可立即用于实验的质粒或病毒。此外，该文库中的每个ORF都可被单独的barcode标记以用于筛选实验。我们的ORF文库非常适合用于功能获得性研究和验证CRISPR或RNAi效果，是探究基因功能、疾病机制、治疗反应，以及精简药物开发流程的重要工具。

技术详情

基因列表

我们的ORF集合包含超过16,000个基因，长度范围从100 bp到10,000 bp不等，涵盖多种类型的经典信号通路，比如细胞生长和增殖、免疫反应、发育和分化等。

 

文库设计

细致的文库设计是取得筛选实验成功的基础。以下是您在设计ORF文库时需要考虑的关键因素：

 

 

• 基因递送系统：用于ORF文库的病毒和非病毒的基因递送系统各有其独特的优势和局限。在非病毒系统中，常规质粒简单且成本效益高，适合瞬时表达。PiggyBac是一种非病毒的、基于转座子原理的系统。该系统可将转基因整合到基因组中，并具有很大的转基因装载容量。在病毒系统中，慢病毒载体允许转基因稳定整合到基因组中，实现长期表达。AAV作为一种非整合型病毒类型的基因递送系统，特别是对于体内应用具有高安全性且高递送效率的特点，但其装载容量较小。
• 启动子：取决于您的实验需求，您可能需要使用组成型、诱导型、或者组织特异性启动子。比如使用组织特异性启动子对于体内实验通常是有帮助的。
• 药筛标记基因：在载体中包含抗生素抗性基因对于筛选成功转导的细胞是必要的。如果您使用的是已经带有抗生素抗性的细胞系（例如，293T细胞对新霉素有抗性），请确保你的文库选择了不同的药筛标记基因。我们通常推荐使用嘌呤霉素抗性基因，因为它可以带来快速有效的筛选效果。
• 蛋白标签：添加诸如His或者Flag的蛋白标签或者设计带有GFP和mCherry的融合蛋白将有助于对ORF的表达检测、纯化以及定位。
• 荧光/化学发光报告基因：在ORF表达载体上添加荧光或化学发光报告基因有助于对ORF表达的可视化并进行细胞分选，从而实时追踪细胞事件。根据实验需求，这些报告基因可以直接与ORF相融合以原位标记目的蛋白，也可以被不同的启动子驱动表达实现非原位的且独立的表达效果监测。
• Barcode：在混合文库的筛选实验中，使用细胞和分子barcode可对成千上万种ORF进行经济且高效的分析。设计barcode在载体中的位置时需要策略性的考察，以确保测序结果的有效性以及与文库克隆、筛选以及逆卷积过程的兼容性。

 

混合文库 vs. 阵列文库

云舟生物的ORF文库可以通过混合文库或者阵列文库的形式交付。这两种形式均有各自的实验方法与优势。

 

体外和体内筛选

在体外和体内系统中，云舟生物的专家团队都可以为您进行ORF文库筛选以识别富集的基因。体外筛选快速且技术简单明了，使用您选择的细胞系即可快速识别差异表达的基因。但是需要注意的是，文库在体外筛选的结果有时并不能完全代表体内筛选的结果，这是因为针对体外条件优化的载体可能在体内不具备相当的表达效率。此外，对于在体外表现出特定表达模式的载体，其在体内也可能会有不一样的表现。

对于那些难以在体外培养又或包含在复杂组织结构里的细胞类型，动物模型可以作为一个更可靠的体内ORF文库筛选平台。尽管小鼠和NHP均被用于体内筛选，为保证载体在基因治疗应用中的高效性，与人类高度相似的NHP模型通常更受青睐。体内筛选有多种给药途径可供选择，包括尾静脉注射、面静脉注射（用于新生小鼠和大鼠）、脑室内注射、视网膜下腔注射、玻璃体内注射、鼓室内注射和肌肉注射等。我们所有的动物实验均在获得AAALAC认证的设施中进行。

将ORF文库递送至靶细胞或动物后，通过测定报告基因或barcode的表达来评估候选ORF的活性。可以进行多轮筛选以确保对目标的精准识别。筛选后，提取细胞基因组DNA或总RNA，然后使用其测序和富集/耗竭的分析结果进行逆卷积处理。