基因诱导表达解决方案

 

一体化（All-in-one）载体与双载体系统

为了实现四环素调控的目的基因激活或抑制表达，靶细胞必须同时共表达由TRE启动子驱动的GOI和Tet调节蛋白（tTA、tTS和/或rtTA）。这可以在一体化载体中同时表达目的基因和Tet调控蛋白，或者通过使用双载体系统——目的基因和Tet调控蛋白各自在独立的载体上表达来实现。一体化载体的优势在于，它可以使用单一载体将Tet调控基因表达系统所需的所有成分直接递送至细胞。在双载体系统中，实现目的基因和Tet调控蛋白在靶细胞共表达需要用两种质粒/病毒对靶细胞进行共转染/共转导，而这在技术上更具挑战性，因为并非所有靶细胞都会成功转染/转导两种质粒/病毒。使用双载体系统的另一种方式是用携带目的基因的质粒/病毒转染/转导已经稳定表达Tet调控蛋白的细胞或生物体。然而，这种方法的问题在于相当费时费力。双载体系也有一定的优势，它可以灵活使用表达相同的Tet调控蛋白的质粒、病毒或细胞系去搭配多种不同的目的基因表达质粒/病毒。

 

组织特异性的Tet诱导表达

云舟生物提供两种类型的一体化Tet-On载体系统：标准形式和低泄漏形式，以帮助您实现目的基因的组织特异性诱导表达。对于标准的Tet-On载体系统，作为融合蛋白的tTS和rtTA其表达使用用户选择的组织特异性启动子进行驱动，而低泄漏Tet-On载体系统则使用广泛启动子来驱动tTS表达，同时使用用户选择的组织特异性启动子驱动rtTA表达。低泄漏形式的载体设计具有特别的优势：在无四环素的情况下最大限度减少非靶组织中的泄漏表达，同时允许在四环素存在的情况下对目的转基因进行组织特异性诱导表达。

 

试验验证

与通常的仅依赖rtTA的Tet-On载体系统在非诱导的情况下具有显着的渗漏表达的情况不同，我们的表达tTS/rtTA的Tet-On载体系统是一个真正的利用四环素作为开关来调控基因表达的系统，可以最大限度地减少非诱导时的背景表达，并且在四环素诱导时的具有相当高的灵敏度和高的动态范围（图2）。在无四环素的情况下，tTS蛋白与TRE启动子结合，从而主动抑制基因转录，从而最大限度地减少背景表达。另一方面，rtTA蛋白仅在四环素存在的情况下与TRE启动子结合以激活基因转录。

 

图2 向HEK293T细胞转染以下载体：表达EGFP和rtTA的一体化载体（Tet-On）（上）、表达EGFP和tTS/rtTA的一体化载体（Tet-On）（下）。转染后48小时，对添加多西环素（+Dox）和不添加多西环素（-Dox）的细胞分别检测EGFP表达。

 

对于使用慢病毒递送方式的Tet载体系统，我们通常不建议使用一体化的载体设计。根据我们的内部数据和许多客户的反馈，使用一体化载体设计的慢病毒的其基因诱导表达效率取决于具体实验并且通常不能令人满意。一体化的载体通常包含两个基因表达盒：由TRE启动子驱动的目的基因表达盒和Tet调控蛋白（如tTA、tTS和/或rtTA）表达盒。对于慢病毒载体，携带多个基因表达盒有时会出现问题，因为正确包装病毒的生物学要求与不同表达盒独立表达的需求之间可能存在冲突。在慢病毒载体上，内部核苷酸多腺苷化信号不能放置在两个LTR之间，因为这会阻断病毒包装过程。因此，由上游启动子启动的转录不会在上游ORF的末端停止，而且会进一步通过转录启动子和ORF，这会导致下游ORF的表达发生部分抑制。在一体化慢病毒载体中，由于Tet调控蛋白位于目的基因下游，它们的表达会大大降低，从而导致泄漏表达和诱导效率低下等问题（图3）。

 

图3 使用双载体（Dual）系统和一体化（All-in-One）载体系统的Tet-On慢病毒转导HEK293T细胞表达EGFP。对于双载体系统，TRE启动子驱动表达的慢病毒载体转导表达tTS/rtTA的稳转株。转导后48小时，对添加多西环素（+Dox）和不添加多西环素（-Dox）的细胞进行EGFP表达检测。