NCG-hIL15 免疫缺陷小鼠模型 人源化模型 ki基因敲

NCG-hIL15

品系名称：NOD/ShiLtJGpt-Prkdc^em26Cd52Il2rg^em26Cd22Il15^{em1Cin(hIL15)}/Gpt

品系类型：Knock-in

品系编号：T004886

品系背景：NOD/ShiLtJGpt

一、品系描述

NOD/ShiltJGpt遗传背景小鼠具有天然免疫缺陷，如补体系统、巨噬细胞缺陷^[1]。Prkdc基因突变会导致VDJ重组受损（scid鼠），造成T细胞和B细胞不能发育成熟，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷^[2]。Il2receptor gamma（IL2rγ）链是具有重要免疫功能的细胞因子IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21的共同受体亚基，将编码IL2rγ的IL2rg基因敲除小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失^[3]。通过基因编辑技术在NOD/ShiLtJGpt小鼠上敲除Prkdc及Il2rg基因制作的高度免疫缺陷模型NCG，背景较单一，寿命长，缺乏成熟的T细胞、B细胞和NK细胞，缺乏补体活性^[4]。

IL15（白细胞介素-15）是一种多效性细胞因子，由活化的单核－巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生，发挥类似IL2的生物学活性，具有激活T细胞、B细胞和NK细胞，并可介导这些细胞的增殖和存活功能^[5,6]。为此，我们在NCG小鼠模型上进行人源化IL15基因的敲入，获得自主产权品系NCG-hIL15，该小鼠可支持人源NK细胞的定植及活性。通过表型分析验证的NCG-hIL15小鼠，可以与其它人源化细胞因子的小鼠模型配繁，亦将成为人源免疫系统重建的重要模型。

二、应用领域

1.用于制备免疫系统人源化小鼠模型，如接种PBMC、HSC获得的免疫系统人源化小鼠模型；

2.用于人源细胞、组织移植；

3.接种人源肿瘤用于筛选相关药物；

4.用于人类造血系统和免疫系统研究。

三、验证数据

1、NCG-hIL15小鼠人源IL15mRNA表达水平验证

图1对比NCG-hIL15小鼠人源IL15和NCG小鼠鼠源IL15mRNA表达水平

通过Q-PCR检测发现NCG-hIL15人源化小鼠中人源IL15组织表达特异性与NCG背景鼠中鼠源IL15表达特异性一致。

2. NCG-hIL15小鼠外周血中人源IL15表达水平

图2NCG和NCG-hIL15小鼠外周血中人源IL15的含量比较

通过ELISA检测发现NCG小鼠外周血血浆中未检测到人源IL15，而NCG-hIL15人源化小鼠的杂合子及纯合子中均能检测到人源IL15的表达，且纯合子表达水平高于杂合子。

2. HuHSC-NCG-hIL15造模流程

NCG-hIL15小鼠移植CD34+HSC后，相对于huPBMC重建速度慢，GvHD发生延迟，生存周期超过18周，延长了给药窗口期。huHSC-NCG小鼠的免疫重建效率高，主要重建T细胞和大量未成熟的B细胞，以及少量NK细胞和巨噬细胞等，可用于肿瘤免疫治疗药物的评价。

图3huHSC- NCG-hIL15重建过程

 

2. HuHSC-NCG-hIL15生长曲线和体重变化

图4人源HSC重建后NCG及NCG-hIL15小鼠生存率和体重变化情况

免疫重建过程中huHSC-NCG及huHSC-NCG-hIL15小鼠体重呈上升趋势。

2. huHSC-NCG及huHSC-NCG-hIL15小鼠外周血免疫重建表型

图5huHSC-NCG及huHSC-NCG-hIL15小鼠外周血中各细胞组份的重建情况

于7、9、11、13周收集huHSC-NCG及huHSC-NCG-hIL15小鼠外周血，采用流式细胞技术检测huHSC-NCG小鼠及huHSC-NCG-hIL15小鼠人源化进程。检测指标为hCD45，hCD3，hCD19，hCD4，hCD8，hCD56。随着免疫重建进程，5周左右huHSC-NCG-hIL15小鼠外周血中hCD45+白细胞水平在已达20%以上，其中hCD3+T细胞水平逐渐增加，且分化出hCD4+T及hCD8+T细胞亚群。与huHSC-NCG小鼠相比，CD56+NK细胞重建水平明显升高。

2. huHSC-NCG及huHSC-NCG-hIL15小鼠外周血中NK细胞功能蛋白检测

图6huHSC-NCG及huHSC-NCG-hIL15小鼠外周血中重建人源NK细胞功能性蛋白检测

于13周（W13）收集huHSC-NCG及huHSC-NCG-hIL15小鼠外周血，采用流式细胞技术检测huHSC-NCG小鼠及huHSC-NCG-hIL15小鼠外周血中重建的人源NK细胞功能基因表达情况。检测指标为CD56、CD16、KIR2DL、NKG2D。与huHSC-NCG相比，huHSC-NCG-hIL15小鼠人源NK细胞重建水平显著升高，且可以表达KIR2DL、NKG2D功能性蛋白。

2. NK细胞功能性数据验证

图7NCG-hIL15小鼠中移植人源造血干细胞HSC重建NK细胞杀伤及ADCC作用

随着效靶比的增加（NK：K562=2:1，5:1，10:1），NCG-hIL15人源化小鼠重建NK细胞对于人慢性髓系白血病细胞K562的杀伤率也随之增加（左图）。随着效靶比的增加（NK：Raji=2:1，5:1），NCG-hIL15人源化小鼠重建NK细胞对于Raji细胞的杀伤率也随之增加（右图）。加入0μg/mL及10μg/mL的Rituximab（靶向CD20抗体，主要通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用ADCC杀伤CD20+肿瘤细胞），Rituximab抗体通过NK细胞介导的ADCC作用，对Raji细胞的杀伤作用进一步增强。

图8基于huHSC-NCG-hIL15小鼠体内用药试验

将对数生长期人淋巴瘤细胞Raji细胞接种到huHSC-NCG-hIL15小鼠皮下，待肿瘤生长至平均体积约40-50mm3时，随机分为PBS组，Rituximab给药组及Blincyto（靶向CD3及CD19的双特异性抗体，主要通过介导CD3+T细胞杀伤CD19+肿瘤细胞）给药组，并使用相应的药物进行治疗。

结果显示：Rituximab组（TGI=48.95%）及Blincyto组（TGI=59.67%）对huHSC-NCG-hIL15的Raji细胞荷瘤鼠上肿瘤生长有显著的抑制作用。

结果证明：移植人源造血干细胞HSC的NCG-hIL15小鼠结合人来源的肿瘤构建的动物模型可以用于评价借助T细胞及NK细胞发挥抗肿瘤作用的肿瘤免疫治疗相关药效评估。

参考文献

1. Shultz LD, Schweitzer PA, Christianson SW, et al. (1995). "Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice". J. Immunol. 154 (1): 180–91.

2. Takenaka K, Prasolava TK, Wang JC, et al. (2007). "Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells". Nat. Immunol. 8 (12): 1313–23.

3. Greiner DL, Hesselton RA, Shultz LD (1998). "SCID mouse models of human stem cell engraftment". Stem Cells. 16 (3): 166–177.

4. Cao X, Shores EW, Hu-Li J, et al. (1995). "Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain". Immunity. 2 (3): 223–38.

5. Ali, A. K., Nandagopal, N. & Lee, S. H. (2015). “IL-15-PI3K-AKT-mTOR: A Critical Pathway in the Life Journey of Natural Killer Cells”. Frontiers in immunology. 6, 355.

6. Fehniger, T. A. et al. (2001). “Fatal leukemia in interleukin 15 transgenic mice follows early expansions in natural killer and memory phenotype CD8+ T cells”. The Journal of experimental medicine. 193, 219-231,.