(四)细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测
细胞培养中,细胞间交叉污染并不罕见,多是由于在培养中操作时各种细胞同时进行,混杂使用器皿和液体所致,这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化,有些变化较轻、不易察觉,有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制,最终死亡。常用观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。
三、污染的预防:防止污染,预防是关键,预防措施应该贯穿整个细胞培养的始终。
1、器皿准备中的预防:用于细胞培养的器皿应该严格消毒,做到真正洁净;应该无菌的物品,要做到消毒严格、真正无菌;器皿的运输、贮存过程中,要严格操作,谨防污染。
2、开始操作前的预防:应当按厂家规定,定期清洗或更换超净台的空气滤网,请专职人员定期检查超净台的空气净化标准;检查培养皿是否有消毒标志,有条件得实验室可以使用一次性用品;检查新配置的培养液,确认无菌方可使用;操作前提前半小时启动超净台的紫外灯消毒;操作应戴口罩,消毒双手。
3、操作过程中的预防;主要包括:超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与风向相逆,不允许用手触及器皿的无菌部分,如瓶口和瓶塞内侧;在安装吸管冒、开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯烧灼,并在火焰附件工作;吸取培养液、细胞悬液等液体时,应专管专用,防止污染扩大或造成培养物的交叉污染;使用培养液前,不易较早开启瓶口;开瓶后的培养瓶应保持斜位,避免直立;不再使用的培养液应立即封口;培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中;操作时不要交谈、咳嗽,以防唾沫和呼出气流引发污染;操作完毕后应将工作台面整理好,并消毒擦拭工作面,关闭超净台。
4、其他预防:及早冻存培养物;重要的细胞株传代工作应有两个人独立进行;购入的未灭活血清应采取56度水浴灭活30分钟使血清的补体和支原体灭活;为了避免诱导抗药细菌,应定期更换培养系统的抗生素,或尽可能不用抗生素;对新购入的细胞株应加强观察,防止外来的污染源;定期消毒培养箱。
四、污染的排除:培养的细胞一旦污染应及时处理,防止污染其他细胞。通常选高压灭菌被污染的细胞,然后弃掉。如果有价值的细胞被污染,并且污染程度较轻,可以通过及时排除污染物,挽救细胞恢复正常。常用的排除微生物污染的方法有以下几种:
1、抗生素排除法:抗生素是细胞培养中杀灭细菌的主要手段。各种抗生素性质不同,对微生物作用也不同,联合应用比单用效果好,预防性应用比污染后应用好;如果发生微生物污染后再使用抗生素,常难以根除。有的抗生素对细菌仅有抑制作用,无杀灭效应。反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性,而且对细胞本身也有一定影响,因此有人主张尽量不用抗生素处理,当然,一些有价值的细胞被污染后,仍需要用抗生素挽救,在这种情况下,可采用5-10倍于常用量的冲击法,加入高浓度抗生素后作用24-48小时,再换入常规的培养液,有时可以奏效。
2、加温除菌:根据支原体耐热性能差的特点。有人将受支原体污染的细胞置于41度中作用5-10小时(最长可以达18小时)杀灭支原体。但是41度对细胞本身应有较大影响,故在处理前,应先进行预试验,确定最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。
3、动物体内接种:受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔,借动物体内免疫系统消灭掉微生物,肿瘤细胞却能在体内生长,待一定时间,从体内取出再进行培养繁殖。
4、与巨噬细胞共培养:在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活7-10天,并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的科隆生长。与体内情况相似,巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。利用96孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养,可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度地同时,更有效地发挥巨噬细胞清除污染地效能。本方法与抗生素联合应用效果更佳。
第四章 动物细胞大规模培养技术
第一节 大规模培养技术应用简介
通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。20世界60-70年代,就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来,由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增,以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善,动物细胞大规模培养技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培养技术(large-scale culture technology)是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等),在细胞生物反应器(bioreactor)中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢)细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞,是贴壁依赖的成纤维细胞)等,并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来,该技术经有了很大发展,从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube等贴壁细胞培养,发展为生物反应器(Bioreactor)进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产:一是在工艺生产时不能大规模制备产品;二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性;三是难以对同批生产进行生产和质量控制。
随着生物技术的发展,迫切需要大规模的细胞培养,特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞,以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法,已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70年代以来,细胞培养用生物反应器有很大的发展,种类越来越多,规模越来越大,较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器,中空纤维管反应器,无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。八十年代以来,人们逐渐开始以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。
动物细胞是一种无细胞壁的真核细胞,生长缓慢,对培养环境十分敏感。采用传统的生物化工技术进行动物细胞大量培养,除了要满足培养过程必需的营养要求外,有必要建立合理的控制模型,进行pH和溶氧(DO)的最佳控制。细胞生物反应器可通过微机有序地定量地控制加入动物细胞培养罐内的空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的流量,使其保持最佳的比例来控制细胞培养液中的pH值和溶氧水平,使系统始终处于最佳状态,以满足动物细胞的生长对pH值和溶解氧的需要。如为提高或达到一定的溶氧水平可改变通入培养罐内气体中氧气和氮气的比例来实现控制DO值的目的。采用二氧化碳/碳酸氢钠(CO2/NaHCO3)缓冲液系统来控制培养液的pH值是一种较好的方法。
现在,由于动物细胞培养技术在规模和可靠性方面都不断发展,且从中得到的蛋白质也被证明是安全有效的,因此人们对动物细胞培养的态度已经发生了改变。许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗,尤其是那些相对较大、较复杂或糖基化(glycosylated)的蛋白质来说,动物细胞培养是首选的生产方式。60年代初,英国AVRI研究所在贴壁细胞系BHK21中将口蹄疫病毒培养成功后,从最初的200ml和800ml玻璃容器开始,很快就放大到30L和100L不锈钢罐的培养规模。使用的是基于Eagle's配方的培养基,补充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后,Wellcome(现为Cooper动物保健)集团分布于欧洲、非洲和南美洲8个国家的生产厂商,应用此项技术工业规模化生产口蹄疫疫苗和兽用狂犬疫苗,已掌握了5000L的细胞罐大规模培养技术。
目前已实现商业化的产品有:口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗、α及β干扰素、血纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促红细胞素、松弛素、生长激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及200种单克隆抗体等。其中,口蹄疫疫苗是动物细胞大规模培养方法生产的主要产品之一。1983年,英国Wellcome公司就已能够利用动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。美国Genentech公司应用SV40为载体,将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达,已生产出乙型肝炎疫苗。英国Wellcome公司采用8000L Namalwa细胞生产α干扰素。英国Celltech公司用气升式生物反应器生α、β和γ干扰素;用无血清培养液在10000L气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。美国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生长激素等。