第四节 肌组织细胞培养
各种肌组织均可用于培养,以心肌和骨骼肌较实用。
(-)骨骼肌细胞培养
1、出生1一2天的乳鼠,引颈处死。
2、无菌取大腿肌组织,切成0.3一0.5cm2小块后,用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,无菌纱网或纱布滤过。
3、计数调整细胞密度。
4、快接种量2×106/皿入培养基培养。
5、培养基内含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促进分化。
接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化,明胶配置:用Hanks液配成0.01%明胶。
该细胞接种率约50%,细胞生长开始呈纺锤形,培养50-52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止,此时可观察到横纹,一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。
(二)心肌细胞培养
心肌细胞是最早的培养材料,Carrel曾长期培养过心肌组织,至今心肌仍不失为好的培养物,最常用的是鸡胚心肌。
心肌比较容易培养和生长,可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法,均可获良好的效果。取心室肌培养较好,原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形,培养成功时,一周后可见节律性收缩现象。
第五节 巨噬细胞培养
巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周,多用做原代培养,难以长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均获恶性,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,以小鼠腹腔取材法最为实用,其法如下:
1、实验前三天,向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml(勿注入肠内!),以刺流产生大量的巨噬细胞。
2、引颈处死小鼠。
3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3-5秒。
4、置动物于解剖台,用针头固定四肢,持镊撕开腹部皮肤,但勿伤及腹膜壁,把皮肤拉向上下两侧,暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同时用手指从两侧压揉腹膜壁,使液体在腹腔内流动。
6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧.使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。
7、小心拔出针头,把液体注入离心管。
8、4℃下250g离心10分钟后,去上清,加10ml Eagle培养基。
9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞,其中90%为巨噬细胞。
10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。
11、接种数小时后,除去培养液,可去除其它白细胞,纯化培养细胞,用Eagle液冲洗1一2次,再加新Eagle培养液置CO2温箱中。