原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液,也不等于不更换培养器皿。
正常细胞培养的世代数有限,只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。
原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了,细胞的生长就会出现停滞,大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去,这些存活的细胞一般能够传到40~50代,这种传代细胞叫做细胞株。细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。当细胞株传至50代以后又会出现“危机”,不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变,并且带有癌变的特点,有可能在培养条件下无限制地传代下去,这种传代细胞称为细胞系。
原代培养是建立各种细胞系(株)必经的阶段,其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。由于原代培养的细胞转化性极小,对病毒敏感性好,因此适应制备疫苗等生物制品;但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤,在所有的操作过程中,都必须保持培养物及生长环境的无菌。
多数情况下,分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞,就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层,这种培养方式称为单层细胞培养(monolayer culture),又叫贴壁培养(adherent culture)。少数情况下,培养的细胞没有贴壁依赖性,可通过专门设备使细胞始终处于悬状态而在体外生长,这种形式称为悬浮培养(suspension culture)。如何让接种的细胞尽快贴壁,是决定培养成功的关键步骤:
取决于适当的生长基质表面;
可降低接种后培养液对细胞的浮力,如先少补加少量培养液,待细胞贴壁后再补足营养液继续培养;
注意适当的细胞接种密度,一般105个/ml左右。
五、传代培养:当原代培养成功以后,随着培养时间的延长和细胞不断分裂,一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内,再进行培养。这个过程就称为传代(passage)或者再培养(subculture)。对单层培养而言,80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
体外培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。传代培养的实质就是分割后再一次培养,可以相对地衡量培养物的培养年龄。
六、生长曲线:细胞接种入培养瓶后,先进入2-24h的延迟期(lag period),然后进入指数生长期(即对数期)(log phase),汇合成单层进入缓慢生长或停滞期(即平台期)(plateau lhase)。每种细胞系(cell line)的这些生长期(growth phase)都是特征性的,只要环境条件保持恒定,每一次测定结果应该是可重复的。
第二节 细胞分离技术
一、从原代组织中分离细胞 将组织块分离(散)成细胞悬液的方法有多种,最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短,以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织,获得较高产量的有活性细胞。
1、胰蛋白酶 (Trypsin)
在去除不需要的组织后,使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm小片,通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀,去除上清液。重复清洗2到3次。
将盛有组织碎片的容器置于冰上,去除残留的上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶(100mg组织加入1ml 胰蛋白酶)。
在4℃孵育6到18小时,使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
移弃组织碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
在组织碎片加入热的完全培养基,用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基,要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过无菌不锈钢丝网(100~200mm)过滤,分散所有剩余组织。计数和接种细胞,进行培养。