有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基,成分可能如下:
包含10%甘油的完全培养基,
包含10%二甲基亚砜(DMSO)的完全培养基,
50% 细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基,或
50% 细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。
对于无血清培养基,一些普通的培养基成分可能是:
50% 细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基,或
包含有7.5%二甲基亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。
1、悬浮细胞
计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200~400g离心5分钟沉淀细胞,使用移液管移去上清到最小体积,不要搅乱细胞。
以1×107到5×107细胞/ml密度,在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞,或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中,再次悬浮细胞。
分装进冻存管,将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中,5分钟内开始冷冻步骤。
细胞以1℃/分钟进行冷冻,可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后转移到液氮中贮存。
2、贴壁细胞
使用分离试剂从基层分离细胞,分离时尽可能温和,使对细胞的损伤减少到最小。
在完全生长培养基中,再次悬浮分离细胞,确定有活力细胞数。
以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积,不要搅乱细胞。
以5×106到1×106细胞/ml密度,在冻存液中悬浮细胞。
分装进冻存管,将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中,5分钟内开始冷冻步骤。
细胞以1℃/分钟进行冷冻,可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后转移到液氮中贮存。
二、冻存细胞的复苏:冻存细胞较脆弱,要轻柔操作。冻存细胞要快速融化,并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂(DMSO或甘油)敏感,离心去除冻存培养基,然后加入完全生长培养基中。
1、直接铺板方法
取出贮存细胞,37℃水浴中快速融化。
直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数,细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。
培养细胞12到24小时,更换新鲜的完全生长培养基,去除冻存剂。