2、胶原酶 (Collagenase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗组织碎片几次。
加入胶原酶(50~200单位/ml,溶解在HBSS中)。
在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的胶原酶。
通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
再一次在培养基中悬浮细胞,计数和接种细胞,进行培养。
3、Dispase
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片,用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
加入Dispase(0.6~2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液)
在37℃孵育20分钟到几个小时。
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的Dispase。
通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。
再一次在培养基中悬浮细胞,计数和接种细胞,进行培养。
二、从原培养容器中分离细胞:以下是从基层迅速分离细胞,且保持细胞完整性的一般步骤。这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用,每一种系统最佳条件和施用浓度应该根据经验加以确定。
再次培养时检测细胞的活性。
细胞的活率应该超过90%
对于无血清培养基,降低胰蛋白酶使用量。
1、移弃使用过的细胞培养基。
2、使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸.)清洗细胞(看表确定正确的清洗溶液)。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液,通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层,然后去除清洗液。
3、以2~3ml/25cm2的量,加选择的分离液(见表)到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃孵育培养瓶,轻轻摇动培养瓶。通常,在5到15分钟内,细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程,避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系,可以轻轻敲打,以加速分离过程。
4、当细胞完全分离时,垂直放置培养瓶,让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基,通过移液管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。
5、对于无血清培养基,加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用1∶1(v∶v)0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。
第三节 细胞的冻存与复苏
为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑,考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异,有时因寄赠、交换和购买,培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室,最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(-70℃~-196℃)的特点。细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时,细胞内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。细胞低温保存的关键,在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内,水晶呈针状,极易招致细胞的严重损伤。
一、细胞的冻存:为避免污染造成的损失,最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化,需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前,细胞应该特性化并检查是否污染。