三、使用无血清培养基的优点
增加确定性
性能更加一致
容易进行纯化和下游加工
细胞功能的精确评估
增强生长和/或产量
生理反应性的较好对照
增强细胞内中介物的检测
第六节 无蛋白培养基与限定化学成分培养基
一、无蛋白培养基(protein free midium,PFM):即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白,如胰岛素,转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势来看,不含动物蛋白的培养基又广泛的应用前景,许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体,如果再生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基,纯化过程就比较复杂,最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这发展趋势而出现的,许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞生长的无蛋白培养基。
二、限定化学成分培养基(chemical defined medium,CDM):是指培养基中的素有成分都是明确的,它同样不含有动物蛋白,同样也不是添加了植物水解物,而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM问世,上海恒利安生物科技有限公司生产的水解乳蛋白培养基就属于CDM。
第七节 其他细胞培养用液
在细胞培养过程中,除了培养基外,还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH调整液等。
一、平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS):主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。最简单的BSS是Ringer。D-Hank's与Hank's的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+,因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有较高的NaHCO3(2.2g/L),适合于5%CO2的培养条件,Hank's平衡液仅含有0.35g/L NaHCO3,不能用于5%CO2的环境,若放入CO2培养相,溶液将迅速变酸,使用时应注意。
配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+,应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。
二、消化液:取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液,传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来,常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液和EDTA溶液,有时也用胶原酶(collagenase)溶液。
1、胰酶溶液:胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示,常见有1:125和1:250,即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度,配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液(如前面的D-Hank's),因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9,配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右,充分溶解,过滤除菌。过滤后可以再调只pH7.5,也可不调。
使用细胞清洗液配制胰酶消化液:含0.5%胰酶的细胞清洗液(100ml细胞清洗液加0.5g胰酶),过滤除菌,分装于4度保存。
2、EDTA溶液:EDTA溶液也常用来解离细胞,它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞,还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%,配制时应加碱助溶,配制后可过滤除菌,也可高温消毒灭菌。
3、胶原酶溶液:胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用,胶原酶作用的对象是胶原组织,因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的最佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制,配制时可用PBS。