第六节 肾小球分离、移植培养
SD大鼠颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡1~2分钟,2次,置超净台内,打开腹腔取出肾脏剪碎,置含Hank's液的无菌培养皿洗涤,置80目不锈钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网,滤过组织Hank's液混合物用吸管吸至120目不锈钢筛网,滤过,去小组织块,滤过物吸至200目不锈钢筛网,轻轻滤过,Hank's液洗涤1次,收集网上肾小球,镜下观察为分离良好的肾小球。
肾小球用0.2%胰酶、0.1%胶原酶,37℃消化20分钟,加血清终止胰酶反应,离心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至24孔培养板或25ml培养瓶,使肾小球大于60个/cm2,加培养基5~10ml(培养基组成:F12—3T3上清1:1;5%马血清;2.5%胎牛血清;胰岛素5μg/ml;25ng/ml氢化可的松;5μg/ml转铁蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲状腺素0.02ng/ml;D-缬氨酸150ng/ml)肾小球培养8~10天,去除肾小球未生长组分,细胞继续培养24小时,形态学观察:细胞生长成单层多角型细胞,直径约100μm。
第七节 裸小鼠移植瘤单细胞分离培养
无菌条件下取出小鼠移植瘤组织,剪成1mm3小块,用0.5%胶原酶室温消化30分钟到1小时,再加等体积0.2%胰酶消化5~8分钟,在消化过程中用吸管吹打组织块或用自制装置(分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成,滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞)来回推动注射器吹打组织以分离单细胞,终止酶消化方法同上。
常规方法接种培养收获细胞。
第六章 肿瘤细胞的培养
肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置,首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性
肿瘤细胞与体内正常细胞相比,不论在体内或在体外,在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞,其差异较小,但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点:
(-)形态和性状
培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态,大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰,核膜、核仁轮廓明显,核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密,微丝走行不如正常细胞规则,可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
(二)生长增殖
肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性,在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖,是因血清中含有很细胞增殖生长的因子,而癌细胞在低血清中(2%~5%)仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后,出现能在低血清培养基中生长的现象,已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时,形成集落(克隆)的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时,接触抑制消除,细胞能相互重叠向三维空间发展,形成堆积物。
(三)永生性
永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡(Apoptosis)。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状,体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽,从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此?也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明,如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的,肿瘤细胞应易于培养。事实上,多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛;经过纯化成单一化瘤细胞后,也大多增殖若干代后,便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性,顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系,如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞证明,永生性和恶性(包括浸润性)是两种性状,受不同基因调控,但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。
(四)浸润性
浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为,培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时,能浸润入其它组织细胞中,并有穿透人工隔膜生长的能力。
(五)异质性
所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织;处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多,增殖旺盛,中心区有的细胞衰老退化,有的处于周期阻滞状态,那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞(Stem Cells)、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖;把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。
(六)细胞遗传
大多数肿瘤细胞有遗传学改变,如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成,有干细胞系和数个亚系,并不断进行着适应性演变。
(七)其它
肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于:
①依赖性:肿瘤细胞虽有较强克隆生长力,但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存,二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系,可能影响癌细胞增殖生长的活性;
②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释,达不到肿瘤生长的需求,降低肿瘤细胞的生长增殖力;
③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span,只有干细胞才有强的增殖生长能力,但这些细胞数量很少;
④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。