靶向WNT5A非经典信号通路可减轻急性肾损伤中的肾纤维化进展

Targeting WNT5A noncanonical signaling attenuates renal fibrosis progression in acute kidney injury

作者信息Sijie Gu, Haoran Feng, Xiaomei Li, Yang Dong, Yonglin Peng, Qiye Liu, Xuhao Zhang, Jiayin You, Jinwei Zhu, Xiaodong Zhao, Xizhi Guo, Niansong Wang, Ying Fan

PMID40581819

期刊Mol Ther

发布时间2025-10-01

DOI10.1016/j.ymthe.2025.06.039

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实验完整度

高

含人肾活检样本、小鼠IRI/UUO模型、HK-2细胞体外模型及RNA-seq，并有siRNA、AAV过表达、Box5干预和ChIP-qPCR等机制验证。

主要模型

AKI患者肾活检样本及临床队列（32例AKI患者、20例健康志愿者） Wnt5a+/−杂合敲低小鼠及其野生型同窝对照双侧缺血再灌注损伤（IRI）小鼠模型单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型 TGF-β刺激的HK-2人近端肾小管上皮细胞

重点核对

AKI患者肾活检中WNT5A和CD146的免疫组化表达及CKD进展组与缓解组的IOD定量比较 Wnt5a+/−小鼠UUO（术后第7天）和双侧IRI（术后第14天）模型中纤维化标志物Vim、α-SMA、Col1a1的Western blot和组织学定量 SGLT2启动子驱动AAV9-Wnt5a尾静脉注射（4×10^11 vg）过表达小鼠IRI模型中Box5（1 mg/kg，隔日腹腔注射，术后第3天开始）的干预效果 HK-2细胞中TGF-β（10、20、40 ng/mL，48 h）刺激下WNT5A/CD146 siRNA、SP600125（10 μM）和Box5（100 μM）对p-JNK及SNAI1的调控 c-JUN与KLF5在SNAI1启动子（chr20:49,980,981–49,983,059）上的双荧光素酶、ChIP-qPCR、coIP及ML264抑制验证

摘要

预防急性肾损伤（AKI）向慢性肾脏病（CKD）进展仍是一项重大的临床挑战。本研究阐明了WNT5A在加速AKI向CKD转化中的作用及其潜在机制。AKI患者的肾活检显示，近端肾小管中WNT5A及其受体CD146显著上调，且在CKD进展患者中表达更高。在小鼠AKI模型中，Wnt5a敲低可减轻CKD进展。相反，近端肾小管过表达Wnt5a会加重缺血再灌注损伤（IRI）小鼠的肾纤维化，而WNT5A特异性拮抗剂Box5可缓解该纤维化。体外实验中，在转化生长因子β（TGF-β）刺激的HK-2细胞中过表达WNT5A可促进CD146上调、激活JNK磷酸化并增强SNAI1表达。基因沉默WNT5A/CD146及抑制JNK可抑制SNAI1表达并减轻纤维化反应。机制上，JNK介导的c-JUN磷酸化促进其与KLF5在SNAI1启动子处相互作用，驱动肾纤维化。AKI患者血清可溶性CD146水平升高与肾功能相关，且在CKD进展患者中更高。抑制WNT5A可作为延缓AKI进展中肾纤维化的治疗靶点。

临床样本中WNT5A/CD146表达与AKI进展的关联分析

评估WNT5A及其受体CD146在AKI患者肾脏中的表达模式及其与CKD进展的关系

对10例AKI患者肾活检样本和3例肾癌癌旁正常肾组织对照进行WNT5A、CD146免疫组化染色，以IOD定量，并比较AKI缓解组与CKD进展组WNT5A表达；在小鼠IRI模型第3天和第14天进行Wnt5a和CD146免疫荧光染色并以LTL标记近端小管

Wnt5a敲低小鼠AKI模型中的肾功能与纤维化表型验证

明确Wnt5a缺失是否减轻AKI诱导的肾纤维化

采用Wnt5a+/−杂合敲低小鼠及野生型同窝对照建立UUO和双侧IRI模型，通过H&E、Masson三色染色、免疫组化Vim和α-SMA及Western blot检测Wnt5a、Vim、α-SMA、Col1a1

近端肾小管Wnt5a过表达及Box5干预的体内验证

验证近端肾小管Wnt5a过表达是否加重IRI诱导的肾纤维化，以及WNT5A抑制剂Box5能否缓解

通过尾静脉注射SGLT2启动子驱动的AAV9-Wnt5a-EGFP过表达Wnt5a，14天后建立双侧IRI模型，术后第3天开始腹腔注射Box5，第14天取材，进行免疫荧光、H&E、Masson、Vim/α-SMA免疫组化及qPCR检测Wnt5a、FN1、Col1a1、Tgf-β、α-SMA

HK-2细胞中WNT5A/JNK/SNAI1通路的体外机制验证

确定WNT5A是否通过CD146和JNK激活调控SNAI1及纤维化反应

对HK-2细胞进行RNA-seq；在TGF-β刺激下使用Box5、WNT5A siRNA、CD146 siRNA、JNK抑制剂SP600125及WNT5A过表达，Western blot和qPCR检测WNT5A、CD146、COL1A1、VIM、t-JNK、p-JNK、SNAI1、α-SMA

小鼠AKI模型中Wnt5a对JNK磷酸化和Snai1表达的调控验证

在体验证WNT5A调控JNK/SNAI1通路

在Wnt5a敲低小鼠UUO和IRI模型及Wnt5a-AAV过表达IRI小鼠中，通过免疫组化、Western blot和qPCR检测CD146、t-JNK、p-JNK、Snai1，并观察Box5对过表达小鼠中p-JNK和Snai1的影响

c-JUN与KLF5协同调控SNAI1转录的分子机制解析

解析p-JNK下游c-JUN如何调控SNAI1转录

通过ChIP-seq数据库分析c-JUN在SNAI1启动子上游结合峰；在WNT5A过表达HK-2细胞中进行Western blot检测t-c-JUN/p-c-JUN；双荧光素酶报告基因、ChIP-qPCR、KLF5结合基序突变、coIP及KLF5抑制剂ML264处理验证c-JUN与KLF5的协同作用及KLF5结合位点（GCCCCGCCCC，−68至−59 bp）

血清sCD146水平与AKI进展的临床观察性分析

探究血清sCD146是否可用于评估AKI进展和预后

纳入32例AKI患者和20例健康志愿者，ELISA检测血清sCD146，分析其与峰值血清肌酐、eGFR、BUN、Cys C、IFTA%、24 h尿蛋白和UACR的相关性，并比较进展至CKD与恢复患者的sCD146水平

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	DMEM/F-12培养基	Ademas	C8015
胎牛血清	Vazyme	F101-01
细胞处理	转化生长因子β	StemRD	240-B-002
基因沉默	Wnt5a小干扰RNA	Sigma-Aldrich	SASI HS01 00202618
CD146小干扰RNA	Thermo Fisher Scientific	AM16708
质粒转染	Lipofectamine 3000转染试剂	Invitrogen	L3000015
FuGENE转染试剂	Promega	E2311
药物处理	SP600125	MedChemExpress	HY-12041
Box5	MedChemExpress	HY-123071
ML264	MedChemExpress	HY-19994
蛋白提取	T-PER蛋白提取试剂	Invitrogen	78510
磷酸酶/蛋白酶抑制剂混合物	Beyotime	P1045
蛋白定量	BCA蛋白定量试剂盒	Yoche	YSD-500T
Western blot	LumiQ ECL化学发光液	ShareBio	SB-WB012
抗WNT5A抗体	Proteintech	55184-1-AP
抗CD146抗体	Proteintech	17564-1-AP
抗JNK抗体	Proteintech	24164-1-AP
抗磷酸化JNK抗体	Abcam	ab124956
抗c-JUN抗体	Proteintech	24909-1-AP
抗磷酸化c-JUN抗体	Proteintech	80086-1-RR
抗SNAI1抗体	Proteintech	13099-1-AP
抗COL1A1抗体	Proteintech	14695-1-AP
抗波形蛋白抗体	AiFang Biological	AFW21648
抗His标签抗体	Proteintech	66005-1-Ig
抗GAPDH抗体	Proteintech	60004-1-Ig
免疫组化	抗α-SMA抗体	Proteintech	14395-1-AP
抗SNAI1抗体	Abcam	ab167609
免疫荧光	抗CD146小鼠单克隆抗体	Proteintech	66153-1-Ig
组织染色	H&E染色试剂盒	Beyotime	C0105S
Masson三色染色试剂盒	Beyotime	C0189S
RNA提取	RNA提取试剂盒	Vazyme	R410
逆转录	逆转录酶试剂盒	Vazyme	R302-01
实时定量PCR	SYBR Green预混液	Vazyme	Q311-02
RNA-seq	NEBNext poly(A)磁珠纯化试剂	NEB	E7490
NEBNext Ultra定向RNA文库构建系统	NEB	E7760S
双荧光素酶报告基因	双荧光素酶报告基因检测试剂盒	Vazyme	DL101-01
coIP	Protein A/G磁珠	Vazyme	PB101-01
ChIP-qPCR	Protein A/G磁珠	MedChemExpress	HY-K0202
ELISA	sCD146酶联免疫吸附检测试剂盒	Abcam	ab267610

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

DMEM/F-12培养基

Ademas

C8015

胎牛血清

Vazyme

F101-01

细胞处理

转化生长因子β

StemRD

240-B-002

基因沉默

Wnt5a小干扰RNA

Sigma-Aldrich

SASI HS01 00202618

CD146小干扰RNA

Thermo Fisher Scientific

AM16708

质粒转染

Lipofectamine 3000转染试剂

Invitrogen

L3000015

FuGENE转染试剂

Promega

E2311

药物处理

SP600125

MedChemExpress

HY-12041

Box5

MedChemExpress

HY-123071

ML264

MedChemExpress

HY-19994

蛋白提取

T-PER蛋白提取试剂

Invitrogen

78510

磷酸酶/蛋白酶抑制剂混合物

Beyotime

P1045

蛋白定量

BCA蛋白定量试剂盒

Yoche

YSD-500T

Western blot

LumiQ ECL化学发光液

ShareBio

SB-WB012

抗WNT5A抗体

Proteintech

55184-1-AP

抗CD146抗体

Proteintech

17564-1-AP

抗JNK抗体

Proteintech

24164-1-AP

抗磷酸化JNK抗体

Abcam

ab124956

抗c-JUN抗体

Proteintech

24909-1-AP

抗磷酸化c-JUN抗体

Proteintech

80086-1-RR

抗SNAI1抗体

Proteintech

13099-1-AP

抗COL1A1抗体

Proteintech

14695-1-AP

抗波形蛋白抗体

AiFang Biological

AFW21648

抗His标签抗体

Proteintech

66005-1-Ig

抗GAPDH抗体

Proteintech

60004-1-Ig

免疫组化

抗α-SMA抗体

Proteintech

14395-1-AP

抗SNAI1抗体

Abcam

ab167609

免疫荧光

抗CD146小鼠单克隆抗体

Proteintech

66153-1-Ig

组织染色

H&E染色试剂盒

Beyotime

C0105S

Masson三色染色试剂盒

Beyotime

C0189S

RNA提取

RNA提取试剂盒

Vazyme

R410

逆转录

逆转录酶试剂盒

Vazyme

R302-01

实时定量PCR

SYBR Green预混液

Vazyme

Q311-02

RNA-seq

NEBNext poly(A)磁珠纯化试剂

NEB

E7490

NEBNext Ultra定向RNA文库构建系统

NEB

E7760S

双荧光素酶报告基因

双荧光素酶报告基因检测试剂盒

Vazyme

DL101-01

coIP

Protein A/G磁珠

Vazyme

PB101-01

ChIP-qPCR

Protein A/G磁珠

MedChemExpress

HY-K0202

ELISA

sCD146酶联免疫吸附检测试剂盒

Abcam

ab267610

环节	核对要点
临床样本与队列	AKI诊断与分期依据KDIGO标准；AKI进展至CKD定义为90天随访窗口内连续两次eGFR低于90 mL/min/1.73 m2；肾活检10例、sCD146分析32例AKI患者及20例健康志愿者；随访至少3个月；伦理批号2023-YS-121 阅读提示：见Materials and methods中Human biopsy samples小节及Table S1、Table S5
动物模型建立	Wnt5a+/−小鼠6周龄、8周龄成熟后进行实验；IRI为双侧肾血管夹闭30 min，核心体温维持37.0°C ± 0.3°C，术后14天取材；UUO为4-0丝线两点结扎并切断，术后7天取材；麻醉为1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射；术后镇痛为美洛昔康5 mg/kg皮下注射3天；伦理批号2023-0235 阅读提示：见Materials and methods中Animal models、IRI model和UUO model小节
AAV过表达与Box5干预	AAV9-SGLT2-Wnt5a-EGFP剂量4 × 10^11 vg尾静脉注射；注射14天后诱导双侧IRI；Box5剂量1 mg/kg隔日腹腔注射，术后第3天开始；对照注射等体积空载AAV或等体积PBS；IRI后14天取材阅读提示：见Materials and methods中Application of AAV and Wnt5a inhibitors in animal models小节及Figure 3A
HK-2细胞处理	HK-2细胞汇合度50%–60%时处理，处理前饥饿12 h；TGF-β浓度10、20、40 ng/mL处理48 h；siRNA转染浓度50 nM并使用Lipofectamine 3000；SP600125浓度10 μM、Box5浓度100 μM；质粒转染在药物处理前1天使用FuGENE进行阅读提示：见Materials and methods中Cell culture, intervention, and plasmid transfection小节
机制验证实验	SNAI1启动子区域chr20:49,980,981–49,983,059（GRCh38.p14）；KLF5结合基序GCCCCGCCCC及突变位点−68至−59 bp；双荧光素酶检测转染后48 h；coIP使用3 μg KLF5抗体，22°C–25°C孵育180 min；ChIP使用anti-c-JUN和anti-KLF5抗体；ML264抑制KLF5 阅读提示：见Materials and methods中Dual-luciferase reporter assays、CoIP和ChIP-qPCR小节及Figure 6

环节

核对要点

临床样本与队列

AKI诊断与分期依据KDIGO标准；AKI进展至CKD定义为90天随访窗口内连续两次eGFR低于90 mL/min/1.73 m2；肾活检10例、sCD146分析32例AKI患者及20例健康志愿者；随访至少3个月；伦理批号2023-YS-121

阅读提示：见Materials and methods中Human biopsy samples小节及Table S1、Table S5

动物模型建立

Wnt5a+/−小鼠6周龄、8周龄成熟后进行实验；IRI为双侧肾血管夹闭30 min，核心体温维持37.0°C ± 0.3°C，术后14天取材；UUO为4-0丝线两点结扎并切断，术后7天取材；麻醉为1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射；术后镇痛为美洛昔康5 mg/kg皮下注射3天；伦理批号2023-0235

阅读提示：见Materials and methods中Animal models、IRI model和UUO model小节

AAV过表达与Box5干预

AAV9-SGLT2-Wnt5a-EGFP剂量4 × 10^11 vg尾静脉注射；注射14天后诱导双侧IRI；Box5剂量1 mg/kg隔日腹腔注射，术后第3天开始；对照注射等体积空载AAV或等体积PBS；IRI后14天取材

阅读提示：见Materials and methods中Application of AAV and Wnt5a inhibitors in animal models小节及Figure 3A

HK-2细胞处理

HK-2细胞汇合度50%–60%时处理，处理前饥饿12 h；TGF-β浓度10、20、40 ng/mL处理48 h；siRNA转染浓度50 nM并使用Lipofectamine 3000；SP600125浓度10 μM、Box5浓度100 μM；质粒转染在药物处理前1天使用FuGENE进行

阅读提示：见Materials and methods中Cell culture, intervention, and plasmid transfection小节

机制验证实验

SNAI1启动子区域chr20:49,980,981–49,983,059（GRCh38.p14）；KLF5结合基序GCCCCGCCCC及突变位点−68至−59 bp；双荧光素酶检测转染后48 h；coIP使用3 μg KLF5抗体，22°C–25°C孵育180 min；ChIP使用anti-c-JUN和anti-KLF5抗体；ML264抑制KLF5

阅读提示：见Materials and methods中Dual-luciferase reporter assays、CoIP和ChIP-qPCR小节及Figure 6

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