建立HFpEF小鼠模型
通过HFD和L-NAME联合处理模拟人类HFpEF和多因素代谢综合征
雄性C57BL/6N小鼠随机分为ND、HFD+L-NAME及药物处理组，HFD（脂肪含量60%）+L-NAME（1g/kg）喂养以建立模型。
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硝唑尼特保护小鼠高脂饮食（HFD）联合L-NAME“双重打击”诱导的射血分数保留的心力衰竭和代谢综合征
Nitazoxanide protects against heart failure with preserved ejection and metabolic syndrome induced by high-fat diet (HFD) plus L-NAME "two-hit" in mice
实验完整度
高包含预防性和治疗性体内小鼠模型实验、体外细胞实验（心肌细胞、心脏成纤维细胞）及离体血管张力实验，并进行功能验证和初步机制验证。
主要模型
C57BL/6N小鼠HFD+L-NAME诱导HFpEF模型 原代新生小鼠心肌细胞 原代新生小鼠心脏成纤维细胞 大鼠肠系膜动脉环
重点核对
小鼠品系、周龄、体重及饲养环境 HFD脂肪含量和L-NAME剂量 硝唑尼特给药剂量和途径 心脏功能检测指标（E/A、EF、FS） 体外细胞实验的药物浓度和处理时间
摘要
临床抗原虫药物硝唑尼特已被证明可改善实验性糖尿病、脂质代谢紊乱、动脉粥样硬化并抑制炎症。由于射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）的发病机制是多因素的，且与上述疾病密切相关，我们旨在研究硝唑尼特对高脂饮食（HFD）联合L-NAME（Nω-硝基-L-精氨酸甲酯）诱导的小鼠HFpEF和代谢综合征的影响。我们发现，口服硝唑尼特改善了HFD+L-NAME处理小鼠的心脏肥大、心脏纤维化、心脏舒张功能障碍、血压升高、运动耐量受损、葡萄糖处理受损、血清脂质紊乱、肝脂肪变性、白色脂肪组织重量增加和肾脏纤维化。在已建立的HFD+L-NAME诱导的HFpEF和代谢综合征小鼠模型中，硝唑尼特治疗性处理逆转了上述HFD+L-NAME诱导的病理表型。体外实验表明，硝唑尼特的活性代谢物替唑尼特增加了心肌细胞的基线线粒体代谢，抑制了心肌细胞肥大和心脏成纤维细胞的胶原分泌，并放松了去氧肾上腺素和U46619诱导的大鼠肠系膜动脉收缩，表明替唑尼特的直接作用可能部分贡献了硝唑尼特在体内对HFpEF的保护作用。本研究表明硝唑尼特可能是HFpEF和代谢综合征治疗的潜在药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 硝唑尼特能否预防和治疗HFD+L-NAME诱导的小鼠HFpEF及代谢综合征，其潜在机制为何？
- 核心机制
- 硝唑尼特及其活性代谢物替唑尼特作为线粒体解偶联剂，增加心肌细胞基础线粒体代谢，激活AMPK，抑制Akt和STAT3信号，从而抑制心肌肥大和纤维化，并直接舒张血管、降低血压。
- 主要证据
- 预防性和治疗性体内实验显示，硝唑尼特显著改善心脏肥大、纤维化、舒张功能、血压、运动耐量、糖脂代谢、肝脂肪变性和肾纤维化；体外实验证实替唑尼特增加心肌细胞耗氧、抑制心肌细胞肥大和成纤维细胞胶原分泌、舒张肠系膜动脉。
- 研究意义
- 研究表明硝唑尼特可能是HFpEF及代谢综合征治疗的潜在药物，尤其可能适用于心外疾病相关HFpEF。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估心脏表型
验证HFD+L-NAME诱导心脏肥大、纤维化及舒张功能障碍，并评价药物作用
通过超声心动图、组织学染色（WGA、Masson）和Western blot检测心脏重量、心肌细胞面积、胶原沉积及肥大和纤维化标志物。
评估代谢表型
验证HFD+L-NAME诱导的糖脂代谢紊乱和肝脂肪变性，并评估药物改善效果
通过OGTT、血清生化（TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST）、肝组织油红O染色和肝脏TG/TC测定评估代谢变化。
评估血管功能
验证HFD+L-NAME诱导的血压升高和血管功能障碍，并评估药物作用
采用尾袖法测量血压，离体血管张力实验评估胸主动脉和肠系膜动脉收缩和舒张功能。
体外机制验证
探究替唑尼特对心肌细胞、心脏成纤维细胞和血管的直接作用及其分子机制
原代心肌细胞和成纤维细胞分别给予PE、TGF-β1或IL-6刺激，并用替唑尼特处理，检测细胞肥大、胶原分泌、线粒体呼吸及AMPK、Akt、STAT3信号通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验麻醉 | 2,2,2-三溴乙醇 | Sigma | T48402 |
| 动物饲养（饲料） | 高脂饲料（D12492） | Biopike | M23010401 |
| 正常饲料（D12450J） | Biopike | M10110C2 | |
| 动物造模 | L-NAME | YuanyeBio-Technology | 51298-62-5 |
| 药物处理 | 硝唑尼特 | Adamas-beta | 01088480 |
| 达格列净 | AstraZeneca | -- | |
| 超声心动图 | Vevo 3100LT 超声系统 | VisualSonics | -- |
| 超声心动图麻醉 | 异氟烷 | RWD | R510-22-10 |
| 血糖测量 | Accu-Chek Active 血糖仪 | Roche Diagnostics | -- |
| 血压测量 | 无创血压监测仪 | Kent Scientific | -- |
| 运动实验 | 跑步机 | NJKEWBIO | -- |
| 握力测试 | 握力计 | Xinruan Information Technology | -- |
| 组织学染色 | Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1346 |
| 油红O染液 | Sangon Biotech | A600395 | |
| 麦胚凝集素（WGA）偶联物 | Thermo Fisher Scientific | W11262 | |
| O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek USA | 4583 | |
| 显微镜 | Olympus | -- | |
| 血清检测 | NT-proBNP ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0834c |
| 总胆固醇检测试剂盒 | Jiancheng | A111-1-1 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Jiancheng | A110-1-1 | |
| 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 | Jiancheng | A112-1-1 | |
| 低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 | Jiancheng | A113-1-1 | |
| 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Jiancheng | C010-2-1 | |
| 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Jiancheng | C009-2-1 | |
| 脂质分析 | 组织甘油三酯和胆固醇检测试剂盒 | Applygen | E1026 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白测定试剂盒 | BeyoTime | P0012 |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| 山羊抗小鼠IgG（IRDye 800CW） | LI-COR Biosciences | 926e32210 | |
| 山羊抗兔IgG（IRDye 800CW） | LI-COR Biosciences | 926e32211 | |
| Odyssey Dlx红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| β-actin抗体 | Bioss | bs-0061R | |
| ANP抗体 | Abclonal | A14755 | |
| BNP抗体 | Abclonal | A23996 | |
| Collagen-1抗体 | Proteintech | 14695-1-AP | |
| β-MHC抗体 | Sigma | M8421 | |
| p-AMPKα (Thr172)抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| p-Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| p-STAT3 (Y705)抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 4904 | |
| 细胞培养 | Hank's平衡盐溶液 | Biosharp | BL559A |
| 胰蛋白酶 | Solarbio | T1300 | |
| II型胶原酶 | Gibco | 9001-12-1 | |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995500 | |
| 胎牛血清 | Gibco | TN-10099141 | |
| 青链霉素溶液 | Beyotime | C0222 | |
| 细胞处理 | 转化生长因子-β1 | Meilunbio | MA0626 |
| 白细胞介素-6 | Proteintech | 216-16 | |
| 替唑尼特 | MCE | HY-12687 | |
| 免疫荧光 | 波形蛋白抗体 | Abclonal | 19607 |
| α-actinin抗体 | Cell Signaling Technology | 69758S | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | Abcam | ab150079 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Abcam | 150113 | |
| DAPI | Solarbio | C0060 | |
| 鬼笔环肽偶联物 | -- | -- | |
| 血管张力测量 | 多线肌动描记系统 | Danish MyoTechnology | model |
| 乙酰胆碱 | Sigma | A6625 | |
| U46619 | Cayman Chemical | 56985-40-1 | |
| 线粒体功能测定 | Oxygraph-2k 高分辨率呼吸仪 | Oroboros Instruments | -- |
| 寡霉素 | Sigma | O4876 | |
| 鱼藤酮 | Sigma | R8875 | |
| FCCP | Sigma | -- | |
| L-谷氨酸 | Sigma | G1626 | |
| L-苹果酸 | Sigma | M1000 | |
| 琥珀酸 | Sigma | S2378 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A7631 | |
| 线粒体呼吸介质 | EGTA | Sigma | E4378 |
| 六水氯化镁 | Scharlau | MA0036 | |
| 乳糖酸 | Aladdin | L109639 | |
| 牛磺酸 | Sigma | T0625 | |
| 磷酸二氢钾 | Merck | 104873 | |
| HEPES | Biofroxx | 1112GR100 | |
| D-蔗糖 | PhytoTech Labs | S391 | |
| 牛血清白蛋白（无脂肪酸） | Biosharp | BS260 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6N）、性别（雄性）、周龄（8周）、体重范围、HFD脂肪含量（60%）、L-NAME剂量（1g/kg） 阅读提示：Methods 2.1 Animals |
| 药物干预 | 给药剂量（预防：100、150、200/75 mg/kg；治疗：150 mg/kg）、给药途径（灌胃）、给药频率（每日一次）、溶剂（0.5%甲基纤维素）、阳性药达格列净剂量（2 mg/kg） 阅读提示：Methods 2.1 Animals; Results 3.1 和 3.7 |
| 心脏功能评估 | 超声心动图参数（E/A、EF、FS等）、麻醉方法（异氟烷）、心率范围、测量次数 阅读提示：Methods 2.2 Echocardiography |
| 代谢功能评估 | OGTT实验条件（禁食6小时、葡萄糖剂量2g/kg、测量时间点）、血清指标（TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST） 阅读提示：Methods 2.3 和 2.8 |
| 体外细胞实验 | 细胞类型（原代心肌细胞、心脏成纤维细胞）、刺激物及浓度（PE 100μmol/L、TGF-β1 10ng/mL、IL-6 50ng/mL）、替唑尼特浓度（1-10μmol/L）、处理时间（24h） 阅读提示：Methods 2.11 和 2.12 |
| 线粒体功能测定 | 仪器（Oxygraph-2k）、细胞密度（1×10^6/mL）、药物浓度（0.5-10μmol/L）、底物和抑制剂浓度 阅读提示：Methods 2.15 |