体外细胞模型建立及Cel细胞摄取评估
评估Cel在人翼状胬肉成纤维细胞（HPFs）中的摄取情况，为后续实验提供基础。
将HPFs暴露于Cel（celastrol浓度为2 µg/mL），在不同时间点测量细胞内荧光强度。
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雷公藤红素激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2轴抑制氧化损伤以减轻结膜下纤维化
Celastrol Activates SIRT1/PGC-1α/Nrf2 Axis to Inhibit Oxidative Damage for Subconjunctival Fibrosis Alleviation
实验完整度
高包含体内大鼠结膜下损伤模型和体外TGF-β1诱导的人翼状胬肉成纤维细胞模型，结合RNA-seq、免疫荧光、Western blot及SIRT1抑制剂干预，实现多层级验证。
主要模型
大鼠结膜下损伤模型 TGF-β1活化的人翼状胬肉成纤维细胞（HPFs）
重点核对
Cel浓度：0.5 µg/mL（体外） EX527浓度：20 µM TGF-β1浓度：10 ng/mL 处理时间：8小时预孵育，12小时TGF-β1刺激 动物分组：模型组、载体组、Cel组，每组8只
摘要
目的：结膜下纤维化可导致睑球粘连和复发性翼状胬肉，严重威胁视力。我们前期研究发现雷公藤红素可抑制结膜下纤维化。本研究旨在探讨雷公藤红素纳米胶束（Cel）抑制结膜下纤维化的潜在机制。方法：我们建立了大鼠结膜下损伤模型和TGF-β1活化的人翼状胬肉成纤维细胞系统来研究纤维化发病机制。采用RNA-seq分析鉴定Cel的靶点。通过免疫荧光和Western blot分析确定Cel是否调节SIRT1/PGC-1α/Nrf2轴，从而减轻体外氧化损伤和结膜下纤维化。通过使用选择性SIRT1拮抗剂EX527进行药理学抑制，明确确立了SIRT1/PGC-1α/Nrf2轴的关键参与。此外，通过组织病理学评估、Masson三色染色和免疫荧光进一步探讨了Cel对体内结膜下纤维化的影响。结果：使用大鼠结膜下损伤模型的体内评估表明，Cel有效减轻了氧化损伤和结膜下纤维化。RNA-seq分析表明SIRT1信号和氧化应激调节是Cel治疗结膜下纤维化的候选靶点。免疫荧光和Western blot结果显示，Cel通过激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2轴和抑制TGF-β1/Smad2/3通路抑制结膜下纤维化，而SIRT1抑制剂消除了Cel的作用。结论：这项工作表明Cel通过激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路抑制氧化损伤，从而有效减轻结膜下纤维化，为阐明Cel作为抑制结膜下纤维化的潜在治疗药物提供了新的潜在机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨雷公藤红素纳米胶束（Cel）抑制结膜下纤维化的潜在机制，特别是SIRT1/PGC-1α/Nrf2轴是否参与其抗纤维化过程。
- 核心机制
- Cel通过激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路抑制氧化损伤，进而下调TGF-β1/Smad2/3通路，减轻结膜下纤维化。
- 主要证据
- 在TGF-β1诱导的HPFs中，Cel增加SIRT1、PGC-1α、Nrf2及抗氧化蛋白NQO1、HO-1、SOD-1的表达，降低NOX4、TGF-β1、TGF-βR II、Smad2/3、p-Smad2/3、α-SMA、COL I和FN的表达；SIRT1抑制剂EX527消除这些效应。在大鼠结膜下损伤模型中，Cel抑制8-OHdG表达、胶原沉积和纤维化。
- 研究意义
- 本研究首次揭示SIRT1/PGC-1α/Nrf2轴在结膜下纤维化中的重要作用，为Cel作为抑制结膜下纤维化的潜在治疗药物提供了新的机制依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Cel对HPFs迁移、收缩和增殖的影响
验证Cel对TGF-β1诱导的HPFs迁移、胶原收缩和增殖的抑制作用。
采用划痕实验检测细胞迁移，胶原收缩实验检测收缩能力，CCK-8法检测增殖。
Cel和载体的生物安全性评估
评估Cel及空白胶束（Vector）对HPFs和角膜上皮细胞系（HCE-2、CCL-20.2）的细胞毒性。
使用CCK-8法检测不同浓度Cel和Vector处理后的细胞活性。
RNA-seq分析鉴定Cel的靶点
通过转录组测序筛选Cel在TGF-β1刺激的HPFs中的差异表达基因及富集通路，以确定潜在靶点。
HPFs分为CON、TGF-β1和Cel三组，TGF-β1处理12小时，Cel预处理8小时，提取RNA进行测序，并进行GO和KEGG富集分析。
Cel对细胞氧化应激和线粒体功能的影响
评估Cel对TGF-β1诱导的ROS产生、线粒体ROS、DNA氧化损伤和线粒体膜电位的影响，并验证SIRT1抑制剂的逆转作用。
HPFs分为CON、TGF-β1、Cel和EX527组，使用DCFH-DA、MitoSOX、8-OHdG染色和JC-1试剂盒检测相关指标。
Cel对SIRT1/PGC-1α/Nrf2轴及下游蛋白的调控
验证Cel是否通过激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2轴来抑制氧化损伤并调节纤维化相关蛋白表达。
通过免疫荧光和Western blot检测SIRT1、PGC-1α、Nrf2、NQO1、HO-1、SOD-1、NOX4及TGF-β1/Smad2/3通路和纤维化标志物（α-SMA、COL I、FN）的表达。
体内药效评估：Cel滴眼液对大鼠结膜下纤维化的影响
验证Cel滴眼液在体内对结膜下损伤诱导的氧化损伤和纤维化的抑制作用。
建立大鼠结膜下损伤模型，分为模型组、载体组和Cel组，每日滴眼两次，持续8周，通过裂隙灯、H&E染色、Masson染色和免疫荧光评估纤维化程度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 雷公藤红素 | 上海药物研究所 | C804877 |
| EX527 | MedChemExpress | 49843-98-3 | |
| 细胞刺激 | 重组人TGF-β1 | MedChemExpress | HY-P70543 |
| 氧化应激检测 | 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | Sigma-Aldrich | 2044-85-1 |
| 线粒体染色 | MitoTracker Green | Invitrogen | M7514 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| RNA提取 | TRIzol | Invitrogen | 15596026CN |
| 线粒体膜电位检测 | 线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1） | Beyotime | C2006 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | -- |
| 胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | 上海Life-iLab Biotech | -- |
| 细胞收缩检测 | 细胞收缩检测试剂盒 | Cell Biolabs Inc. | CBA-201 |
| 免疫印迹/免疫荧光 | 抗SIRT1抗体 | Bioss | bs-0921R |
| 抗PGC-1α抗体 | Bioss | bs-1832R | |
| 抗Nrf2抗体 | Bioss | bs-1074R | |
| 抗NQO1抗体 | Bioss | bs-2184R | |
| 抗HO-1抗体 | Bioss | bs-2075R | |
| 抗SOD-1抗体 | Bioss | bs-10216R | |
| 抗NOX4抗体 | Bioss | bs-1091R | |
| 抗8-OHdG抗体 | Bioss | bs-1278R | |
| 抗TGF-β1抗体 | Bioss | bs-0086R | |
| 抗TGF-βR II抗体 | Bioss | bs-0117R | |
| 抗FN抗体 | Bioss | bs-13455R | |
| 抗α-SMA抗体 | Affinity | AF1032 | |
| 抗Smad2/3抗体 | Affinity | AF6367 | |
| 抗磷酸化Smad2/3抗体 | Affinity | AF3367 | |
| 抗COL I抗体 | Affinity | AF7001 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 20536-1-AP-1 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10094-1-AP | |
| 免疫荧光二抗 | FITC标记的山羊抗兔IgG | Beyotime | A0562 |
| Western blot二抗 | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Absin Bioscience Inc. | abs20040 |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Solarbio | -- |
| 纳米胶束制备 | 聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯 | -- | -- |
| 组织染色 | Masson三色染色 | -- | -- |
| 细胞核染色 | DAPI | -- | 10 μg/mL |
| 胶原收缩实验 | 2,3-丁二酮单肟 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型 | 人翼状胬肉成纤维细胞（HPFs）的分离、培养条件（DMEM/F12+10%FBS，37℃，5%CO2），使用2-5代细胞；人角膜上皮细胞系HCE-2和结膜上皮细胞系CCL-20.2的获取和培养。 阅读提示：Methods中Cell Lines and Cell Culture部分 |
| 药物处理 | Cel浓度0.5 µg/mL，预处理8小时；TGF-β1浓度10 ng/mL，处理12小时；EX527浓度20 µM，预处理24小时；注意Cel浓度在增殖实验中有梯度。 阅读提示：Methods中细胞处理相关部分及Figure legends |
| 划痕实验 | HPFs接种于六孔板，90%融合后换0.5%FBS培养基8小时；划痕后分组：CON、TGF-β1（10 ng/mL）16小时、Cel（0.5 µg/mL）预处理8小时再TGF-β1处理16小时；迁移细胞数统计。 阅读提示：Methods中Scratch Wound Assay部分 |
| 胶原收缩实验 | HPFs密度4×10⁶ cells/mL，胶原工作液与细胞悬液1:4混合；处理分组：CON、TGF-β1（10 ng/mL）24小时、Cel（0.5 µg/mL）预处理8小时；释放后在不同时间点拍照，用ImageJ计算收缩率。 阅读提示：Methods中Collagen Contraction Test部分 |
| 增殖实验 | HPFs以2×10³ cells/well接种96孔板，Cel浓度梯度0-4 µg/mL处理24小时；时间梯度0.5 µg/mL处理24、48、72小时；CCK-8试剂每孔10 µL，孵育4小时，测450 nm吸收。 阅读提示：Methods中Cell Proliferation Assay in HPFs部分 |
| 生物安全性评估 | HCE-2和CCL-20.2以5×10³ cells/well接种，Cel浓度0.063-1 µg/mL处理24小时；时间梯度0.5 µg/mL处理24、48、72小时；Vector浓度3.13-50 µg/mL处理24小时。 阅读提示：Methods中The Safety Evaluation of Cel in HCE-2 and CCL-20.2和The Safety Evaluation of Vector in HPFs, HCE-2, and CCL-20.2部分 |
| 活性氧检测 | DCFH-DA（10 µM）染色30分钟；MitoSOX Red（2 µM）和MitoTracker Green（200 nM）共同孵育；JC-1试剂盒按说明书；荧光显微镜检测。 阅读提示：Methods中Detection of Cellular ROS和Detection of Mitochondrial ROS and Mitochondrial Membrane Potential部分 |
| 蛋白表达检测 | 免疫荧光和Western blot的抗体清单及稀释比例未明确；Western blot使用10%-12.5% SDS-PAGE；蛋白转移至PVDF膜；封闭液5%脱脂奶粉。 阅读提示：Methods中Western Blot Analysis和Immunofluorescence Analysis部分，抗体信息在Reagents and Antibodies部分 |
| 动物模型 | SD大鼠（雌性，8周龄，180-220g）；结膜下损伤8mm×6mm；分组：模型组（0.9%生理盐水）、载体组（100 µg/mL Kolliphor HS 15）、Cel组（2 µg/mL），每日滴眼20µL，每日两次，持续8周。 阅读提示：Methods中Animals和Rat Model of Subconjunctival Injury部分 |
| 组织学分析 | 取材时间：2周和8周；H&E染色、Masson三色染色、免疫荧光检测SIRT1、PGC-1α、Nrf2、8-OHdG、FN、COL I；使用P250 FLASH扫描系统采集图像，ImageJ定量。 阅读提示：Methods中Histopathological Analysis部分 |
| 统计分析 | 每组三个独立重复；组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；P<0.05认为有统计学意义。 阅读提示：Methods中Statistical Analysis部分 |