小鼠破骨细胞培养方案

小鼠骨髓细胞的获得
1.小鼠(6~8周)颈椎脱臼法处死，将处死的小鼠放于含有酒精的小烧杯中浸泡2 min，消毒灭菌，在超净台中手术取出所有的胫骨和股骨，并用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净;
2.将取好的骨头转移到装有无菌PBS的培养皿中，涮洗一次后转移至另一个装有无菌PBS的培养皿。
3.用剪刀剪去骨的两端，再用注射器抽取PBS，针头分别插入两端骨髓腔中，用注射器打入PBS，反复冲洗骨髓至培养皿中，直至骨完全变白;
收集骨髓悬液，用筛网过滤去除小碎片和肌肉组织;4
5.将滤过液500 g/5 min离心，弃去上清;
6.将离心后的沉淀弹散，加入2ml红细胞裂解液(1X)(Cat#64010-00-100)，室温裂解5 min.
注:推荐使用BioGems红细胞裂解液，裂解温和，对骨髓细胞损伤小!
7.加入10 ml完全培养基(a-MEM培养基+10%FBS+双抗)终止裂解，然后500 g/5 min离心，弃去上清;
将离心后的沉淀弹散，用完全培养基(a-MEM培养基+10%FBS+双抗)重悬细胞，至此已8.
获得小鼠骨髓细胞。

破骨细胞诱导分化
1.将细胞重悬到1*10/ml，加入终浓度为5ng/ml的小鼠M-CSF，按10cm的细胞培养皿中加入10 mI细胞悬液铺板，培养过夜;
注:此步骤主要是去除贴壁较快的骨髓基质细胞
2.吸取悬浮细胞，离心，用a-MEM完全培养基重悬到5*105/ml，加入终浓度为30ng/ml的小鼠M-CSF，按96孔板每孔加入200u细胞悬液，加入完成后，左右上下摇晃96孔板几下，在超净台中静止10 min，待细胞沉降后于倒置显微镜下观察是否铺板均匀，铺板均匀后放入37℃培养箱中培养分化3天;(若是24孔板，可加入1.5~2ml诱导分化);
注:此步骤是培养分化为巨噬细胞
3.培养3天后，弃去培养孔内悬浮细胞，并用PBS轻洗2次，配置破骨细胞分化培养基(a-MEM完全培养基加入终浓度为30 ng/ml的小鼠M-CSF和50ng/ml的小鼠RANKL)，96孔板内每孔加入200 u配置好的分化培养基，培养分化3~5天，隔天换液并用PBS轻洗2次。
注:细胞因子购买后请按照说明书指示溶解并稀释保存，不可反复冻融，诱导分化培养基请根据每次的用量配置，用多少，配置多少。
4.分化过程中，每天镜下观察是否有细胞融合，细胞融合70%以上即可固定细胞进行染色鉴定

培养诱导分化所需的细胞因子:

参考文献:
1. BoyleWJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature.2003;423:337-3422. HikataT, Takaishi H, Takito J, et al. PlAS3 negatively regulates RANKL-mediated osteoclastogenesisdirectly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblasts. Blood. 2009;113:2202-22123. HaJ,Choi HS, Lee Y, Kwon HJ, Song YW, Kim HH. CXC chemokine ligand 2 induced by receptoractivator of NF-kappa B ligand enhances osteoclastogenesis. J lmmunol. 2010;184:4717-47244. lshii M, Egen JG, Klauschen F, et al. Sphingosine-1-phosphate mobilizes osteoclast precursors andregulates.bone homeostasis.Nature.2009;458:524-528.