小鼠小肠类器官培养方案

2009年，荷兰科学家Hans Clevers的团队成功地在体外将Lgr5+肠道干细胞培养成包括隐窝样区域和绒毛样上皮区域的三维结构，即小肠类器官，这一结构包含所有终末分化细胞类型，能准确模拟肠道上皮生理情况，这一方法的建立既实现了肠上皮长期体外培养又可以维持肠上皮细胞原始分化能力，该技术已经逐渐被应用于干细胞、疾病模型以及再生药物等相关研究。小肠类器官的培养可以通过多能诱导干细胞或胚胎干细胞来诱导分化，也可以取小肠的隐窝干细胞来诱导分化，目前大多数研究都是采用小肠隐窝干细胞来培养，因为该方法不仅获取干细胞方便，技术要求不高，而且培养的类器官传代次数更多，可以在体外长期培养长达2个月之久。

在进行小肠类器官培养时需要将整个隐窝结构或者单个Lar5+干细胞种植到基质胶中，然后利用无血清培养基进行培养，培养基中含有三种必须的细胞因子，即R-spondin1、EGF、Noggin。其中 R-Spondin1是Wnt通路的激动剂，同时也是Lgr5的配体，在体内可以导致隐窝的大量增殖;EGF与受体结合可以促进小肠上皮细胞的增殖:Noaain是BMP通路的抑制剂，可以增加类器官中隐窝的数量。通过这种方法培养出来的类器官，可以得到上皮细胞紧密连接形成中空的管腔样结构，腔内有凋亡脱落下的细胞。随着类器官的生长，干细胞可通过出芽的方式向外突出生长形成更多的隐窝状结构。培养的类器官中含有各种肠道细胞，目各细胞比例与体内一至，潘氏细胞和内分泌细胞也可以向腔内分泌物质，吸收细胞也具备吸收功能。