小鼠骨髓来源巨噬细胞分化及鉴定

小鼠骨髓来源巨噬细胞分化及鉴定

小鼠骨髓细胞的获得
1.小鼠(6~8周)颈椎脱臼法处死，将处死的小鼠放于含有酒精的小烧杯中浸泡2 min，消毒灭菌，在超净台中手术取出所有的胫骨和股骨，并用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净;
2.将取好的骨头转移到装有无菌PBS的培养皿中，涮洗一次后转移至另一个装有无菌PBS的培养皿;
3.用剪刀剪去骨的两端，再用注射器抽取PBS，针头分别插入两端骨髓腔中，用注射器打入PBS，反复冲洗骨髓至培养皿中，直至骨完全变白;
4.收集骨髓悬液，用筛网过滤去除小碎片和肌肉组织;
5.将滤过液500 g/5 min离心，弃去上清;
6.将离心后的沉淀弹散，加入2ml红细胞裂解液(1X)(Cat#64010-00-100)，室温裂解5 min。
注:推荐使用BioGems红细胞裂解液，裂解温和，对骨髓细胞损伤小!

小鼠骨髓细胞的分化
1.用1640完全培养基(1640培养基+10%FBS+双抗)重悬细胞至1*10?/ml，加入终浓度为20 ng/ml的Murine M-CSF，24孔培养板中加入1ml细胞悬液，此后隔天半量换液，诱导分化6-7天，细胞分化成M0;
2.M1方向分化:分化6-7天后，继续加入100ng/ml的LPS和20ng/ml的Murine IFN-Y，同时还需加入Murine M-CSF，极化24小时;
3.M2方向分化:分化6-7天后，继续加入20ng/ml的MurinelL-4，同时还需加入MurineM-CSF，极化24小时:
细胞鉴定:购买相应的流式抗体进行染色鉴定。

细胞分化所需的细胞因子:

细胞鉴定所需抗体:

参考文献:
1. Zajac E, Schweighofer B, Kupriyanova TA, et al. Angiogenic capacity of M1-and M2-polarized macrophages is determined by the levels of TIMP-1 complexedwith their secreted proMMP-9. Blood. 2013;122:4054-4067.2. Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, et al. Macrophage activation and polarization:nomenclature and experimental guidelines. lmmunity.2014;41:14-20