【Disome-seq-经典研究】 |核糖体"堵车"全基因组图谱：Disome-seq技术揭示翻译暂停新机制

导读：

在细胞这个繁忙的"蛋白质工厂"中，核糖体就像流水线上的工人，沿着mRNA模板合成蛋白质。但这个过程并非总是一帆风顺——核糖体常常会遇到各种"路障"导致暂停甚至"追尾碰撞"。

 

翻译暂停的"黑匣子"关键问题一直未解：核糖体在哪些位置容易"堵车"？是什么序列特征导致了这些"交通事故"？这些暂停对细胞有什么生理意义？

 

 

本研究使用Disome-seq方法分析了人类和斑马鱼中由核糖体暂停引起的核糖体碰撞的位置。碰撞核糖体，即Disome，出现在不同的位点：Pro-Pro/Gly/Asp基序；Arg-X-Lys基序；终止密码子；还有3'UTR。带电新生链和核糖体出口通道之间的静电相互作用决定了eIF5a介导的Pro-Pro位点Disome的拯救。特别是，内质网（ER）应激反应转录因子的前体XBP1u显示出惊人的碰撞核糖体队列，因此通过核糖体相关的质量控制作为降解底物。

 

文章索引：

标题：Genome-wide Survey of Ribosome Collision.

发表期刊：Cell Reports

发表时间：2020.05

作者团队：东京大学前沿科学研究生院 Shintaro Iwasaki团队

IF：6.9

DOI：10.1016/j.celrep.2020.107610.

 

 

 

研究结果

（1）Disome足迹定义核糖体暂停位点

典型的Ribo-seq分析中，分离出由核酸酶酶切产生的17-34 nt长的RNA片段（图1A）。但在Disome-seq分析中，可以由两个核糖体作为一个单位表示碰撞核糖体。理论上，紧密排列的核糖体对可覆盖40-65 nt的mRNA片段。

 

作者首先用XBP1u这个已知会导致核糖体暂停的序列进行验证（图1B）。通过精巧设计的报告系统（上游Renilla荧光素酶和下游firefly荧光素酶中间插入XBP1u暂停位点），他们确认了这个位点确实会造成翻译停滞。此外，在HEK293细胞中，作者发现：单核糖体保护的片段集中在28-29nt，双核糖体保护的片段则主要在52-61nt。这正好符合两个核糖体紧密排列时保护的RNA长度。

 

另外，作者通过全基因组分析发现了核糖体"追尾事故"位置：在起始密码子附近有12nt的"禁停区"——扫描中的核糖体不会发生碰撞。终止密码子附近则是"事故高发区"，特别是61nt的片段大量堆积。这些片段显示出明显的3碱基周期性，证明它们确实来自翻译中的核糖体。

 

（2）精确标注已报道的翻译衰减序列中的暂停位点

Disome-seq分析能够以亚密码子分辨率重新审视早期研究中注释的3个翻译衰减位点。

Ø SEC61B：膜蛋白合成的"检查站"

在SEC61B基因的终止密码子处，Disome-seq清晰捕捉到了核糖体堆积的信号。这与之前研究发现一致——这个位点的暂停为膜蛋白正确插入内质网提供了宝贵时间。

 

 

Ø AZIN1：上游编码区的"减速带"

AZIN1基因的上游保守编码区(uCC)就像一个天然的翻译减速带。Disome-seq不仅验证了这个区域会导致核糖体排队，还精确定位到特定的PS-stop模体是主要"堵点"，而非之前认为的Pro-Pro-Trp模体。

 

Ø ZCRB1：腺苷酸富集区的"交通管制"

即使在ZCRB1 mRNA的腺苷酸富集序列中，Disome-seq也能发现核糖体并非随机暂停，而是在特定密码子位置形成精确的"交通堵塞"。这推翻了之前认为这些序列会导致随机暂停的假设。

 

（3）Disome暂停位点在转录组中广泛存在

通过Disome-seq技术，在人类细胞中绘制了首张全基因组核糖体碰撞图谱。结果显示：超过2,231个碰撞位点分布在1,145个基因中；约11%的基因存在至少一个碰撞热点。终止密码子区域是碰撞最集中的"事故高发区"。

 

典型地，在PRRC2B和TXNRD1基因中，Disome-seq清晰捕捉到了传统方法难以检测的核糖体排队现象：多个核糖体以约30nt的间隔规律排列，这种"连环追尾"可延伸至5个核糖体的长度。碰撞位点具有精确的密码子定位特征。

 

通过元基因分析发现：编码区碰撞呈现11个密码子的周期性间隔，终止密码子区域碰撞最为密集。

 

 

（4）延伸过程中核糖体碰撞相关的motif

Disome-seq分析首次系统揭示了编码区内导致核糖体碰撞的两类关键氨基酸模体：

Pro-Pro/Gly/Asp motif（图4B）：这类氨基酸通过干扰肽酰转移酶中心(PTC)的构象，显著增加核糖体暂停概率（图4D橙色标记）

Arg-X-Lys motif（图4C）：带正电荷的氨基酸组合可能通过静电作用阻碍核糖体移动（图4D浅蓝标记）

 

另外，明确了终止密码子上下文特征（图4E）。在翻译终止阶段，研究发现：

终止密码子下游+4位碱基呈现显著偏好性；当+4位为嘧啶(C)时，eRF1识别效率降低（图4E红标位点），这种特征与核糖体释放延迟直接相关。

对翻译终止后的核糖体动态分析发现（图4F）：约9-15nt的3'UTR区域是核糖体滞留的主要热点，这些"僵尸核糖体"不携带tRNA（图4F峰值区）可能阻碍后续翻译进程，需要专门的回收机制清除。

 

 

 

 

（5）脊椎动物中核糖体碰撞位点的保守性

Disome-seq在斑马鱼胚胎中同样检测到核糖体排队信号，其CDS区域碰撞位点呈现与人类相似的11密码子间隔模式（图5A），证实脊椎动物翻译暂停的普遍性。而且斑马鱼碰撞位点也富集两类特征模体：干扰肽酰转移的Pro-Pro/Gly/Asp模体（图5B）和带正电的Arg-X-Lys模体（图5C），与人类完全一致。

 

 

约30%碰撞位点在人类-斑马鱼间保守（图5E），如HDAC2/hdac1（图5F）和BRD2/brd2a（图5G）同源基因在相同位置出现核糖体堆积，序列偏差≤3密码子。

 

 

保守位点的结构约束（图5D）提示其可能在蛋白质折叠等基础生物学过程中发挥关键作用，Disome-seq首次实现跨物种翻译动态比较。

 

（6）eIF5A救援机制的电荷依赖性调控

Disome-seq研究发现eIF5A对核糖体碰撞的救援呈现电荷依赖性调控（图6A-F）：在HLA-DPA1和STOML2基因中，eIF5A敲除诱导新的Pro-Pro模体位点出现核糖体堆积（图6A-B粉色高亮）；元基因分析显示这些位点在正常细胞中无碰撞（图6E），而eIF5A敲除后显著增加（图6C）。关键机制在于新生肽电荷分布——eIF5A敏感位点带中性/负电荷（图6F左），而抵抗位点带正电荷（图6F右），这种差异解释了Pro-Pro模体位点的异质性（图6D）。

 

 

研究揭示eIF5A通过中和核糖体出口通道静电干扰发挥作用，正电荷会抵消其救援效果，为理解翻译延伸调控提供了新维度。

 

（7）XBP1u蛋白被RQC降解

针对XBP1u mRNA，Disome-seq揭示了核糖体碰撞的独特景观：(A) 长队列的核糖体以11个密码子间隔规律排列，在已知暂停位点（粉色高亮）形成峰值，表明严重的翻译停滞和潜在的RQC靶点。这一现象通过(B) Western blot进一步验证：LTN1敲除或蛋白酶体抑制显著恢复XBP1u蛋白水平，证实其作为内源性RQC底物通过泛素-蛋白酶体途径降解。机制上，(C) 中性PAGE显示ZNF598敲除减少肽酰-tRNA堆积，证明RQC感应器调控通读效率；(D) 荧光素酶报告系统定量确认ZNF598缺失提升通读率（均值±标准差，n=3），确保应激时XBP1u的快速激活。

 

 

这些结果首次揭示无应激条件下RQC对XBP1u的监控机制，为内质网应激反应提供新视角。

 

研究结论

这项研究通过对人类和斑马鱼的Disome-seq分析，调查了整个转录组中的核糖体碰撞位点，发现核糖体的延伸、终止和循环的低效率环境有助于核糖体的碰撞。研究还发现XBP1u是核糖体相关质量控制的内源性靶标。

 

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