单个细胞也能提取核酸？超全干货教你微量样本发高分（含完整电子版宝典资料））
2025-01-03 14:48点击次数：817
关键词：微量核酸样本通常因为过低的起始样本使用常规的实验方法无法完成核酸纯化，导致无法对珍贵的样本例如循环肿瘤细胞、激光显微切割样本等进行研究。Nature Cancer 曾发表的题为 Personalized circulating tumor DNA analysis as a predictive biomarker in solid tumor patients treated with pembrolizumab 的研究成果，发现肿瘤释放到血液中的微量循环肿瘤 DNA（ctDNA）的水平变化能够预测患者的免疫治疗疗效[1]。这项发现为免疫治疗打开了新的突破口，微量核酸样本的成功提取也为珍稀样本带去新的研究方向。
那么，在样本有限的条件下该采用什么手段进行分子分析研究呢？想要了解低至单个细胞或其他类型的微量样本如何提取核酸？想要提高微量核酸样本实验结果的可靠性和重复性？如何知道微量核酸是否足够用于下游的 PCR 或 NGS 实验？
QIAGEN 凯杰与丁香园合作推出「微量样本核酸解决方案」实验宝典，包含了丰富全面的视频讲解，protocol、问题解析和干货文章，教你快速提取核酸及构建文库。除了手把手教你微量核酸提取以外，更有不同样本提取注意事项及难题解答，干货满满！
手册内容提前知
教学视频 + protocol + 图文讲解多个板块共同为您讲解微量核酸提取的全过程及应用场景，涵盖了微量 DNA/RNA 提取、体液样本游离核酸/病原微生物核酸提取、单细胞/微量核酸扩增方案等多块内容。此外，还有多篇文献解析为您拓宽实验思路，满满干货祝您解决核酸提取难题，以下是不同样本破碎和匀浆中常见问题及解决方案：
动物组织如心脏、肌肉以及皮肤组织
组织中含有丰富的收缩蛋白和结缔组织，以及干扰RNA分离的胶原蛋白。
解决方案
- 由于含有丰富的收缩蛋白和结缔组织，组织细胞密度低，其中RNA含量较少，可以适当增加材料的起始用量。
- 务必要在低温冷冻条件下将组织彻底磨碎，并尽快研磨成粉末状。
- 用蛋白酶或含有phenol的试剂处理样本。
内源性RNase含量高的组织如肾脏、肠、脾脏、胸腺以及胰腺
该类样本中RNase含量很高，提取过程中很容易发生RNA的降解。
解决方案
- 尽量使用新鲜组织，采样不宜太大，尽可能缩短样本采集和快速冷冻的时间。
- 即时加入RNA稳定剂，使组织内的RNase失活及保护组织中的RNA。
- 快速匀浆，加入裂解液若粘稠至不能有效分层，可继续加入更多裂解液。
- 采用 RNeasy Mini Kit（货号：74104, QIAGEN）提取时，可将缓冲液RLT中加入的巯基乙醇含量提高至 3～5%，能够有效改善结果。
血液样本
提取得到的RNA量少；由于RNase得到的RNA完整性较差，有降解；污染物包括抗凝剂-肝素和EDTA，以及天然酶抑制剂影响下游RNA分析实验。
解决方案
- 血液越新鲜越好，在血液收集管中使用RNA稳定试剂来保存RNA。
- 血液RNA提取本质上是白细胞RNA提取，使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法回收单核细胞。
- 去除抗凝剂和酶抑制剂。
- 可采用专门用于血液样本的RNA提取试剂盒（如：QIAamp RNA Blood Mini Kit，货号: 52304, QIAGEN），其中含有高效的红细胞裂解液，在有效裂解细胞的同时也能防止其中释放出的大量RNase对后续RNA提取的影响。
FFPE 样本
FFPE样本中的核酸在进⼊福尔马林浸泡之前就开始发⽣降解；样品基质内核酸易发⽣⽚段化、核苷酸碱基修饰以及核酸与蛋⽩的交联。
解决方案
- 使用厚度不超过 5 mm 的组织样本，组织固定前的操作时间应当越短越好，避免RNA降解。
- 不要过度固定（最多 24 小时），固定时间越长，交联程度越⼤，样本中的RNA降解越厉害。
- 推荐使⽤中性的福尔马林缓冲溶液及优质试剂进行石蜡包埋，不含添加剂。
- 尽可能避免样品染色。
- 可考虑使用专门的环保型脱蜡液，降低对实验环境的要求，简化加速实验流程，同时结合高效的交联逆转步骤，提高核酸的回收效率与质量（如:QIAamp DNA FFPE Advanced (UNG) Kit 货号:56704, QIAGEN）。
参考文献：
[1] Bratman SV, et al. Personalized circulating tumor DNA analysis as a predictive biomarker in solid tumor patients treated with pembrolizumab. Nat Cancer, 2020.
