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实验问答

26,709,720 科研人在看

问如何最大限度地降低组织非特异性染色？

赵栋2012

1.缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。5. 缩短DAB孵育时间或降低DAB浓

1 回答1031 围观

问求问 PBS 的清洗方式选择、次数和时间的选择？

tao0129

1. 单独冲洗，防止交叉反应造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。2. 温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲

1 回答2941 围观

问Annexin V 法测细胞凋亡时的阴性对照是什么意思？

赵栋2012

matianzhong战友回答：Annexin V测凋亡一般与PI联合用，Annexin V与早期凋亡细胞膜结合来检测，PI只能进入死细胞和晚期凋亡。制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：1. 没有染色的细胞。2. 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞。3. 仅用PI染色的细胞。

1 回答3101 围观

问为什么抗原修复结果里假阳性很多？

tao0129

1.抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中，因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原性降低，可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来。2.免疫组化中经常使用抗原修复，因为它的原理主要是抗原和抗体反应，通过抗原修复使更多的抗原与抗体结合，避免假阴性结果。3.而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3‘OH结合，故不需抗原修复。4.第一次TUNEL反应只需37度反应1h，或者延长时间即可。

1 回答1332 围观

问内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

赵栋2012

1. 一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10 min 左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30 min。2. 用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。3.现用现配，配好后4℃避光保存。

1 回答2720 围观

问苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长?

赵栋2012

返蓝可以用碱性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45℃温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50 ml 自来水＋三四滴的氢氧化铵。

1 回答6029 围观

问免疫组化结果如何分析？

赵栋2012

1. 阳性着色细胞计数法。在40×光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。2.灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。3.评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（

1 回答2820 围观

问如何把握 DAB 的显色时间？

赵栋2012

1. DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。2. DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间。3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。4. DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能

1 回答3018 围观

问TUNEL 法的实验原理是什么？

tao0129

基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视

1 回答2987 围观

问细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？

tao0129

1.蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加膜通透性，使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应；2.蛋白酶K一般工作液浓度为20 ug/ml ，但浓缩液可配制1~10 mg/ml ，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；3. 蛋白酶K反应时间一般为10~30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4 um 左右的片子可以用10

1 回答5496 围观

问TUNEL 实验中几个关键步骤是什么？

tao0129

1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20 min，再用二甲苯两次5~10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30 min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1 h

1 回答1316 围观

问如何把握苏木素复染时间？

tao0129

1. 苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。2.; 盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。3. 如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。

1 回答2464 围观

问微波修复时是否该阻断？

赵栋2012

1. 微波修复的目的是什么？在免疫组化中是用来抗原修复，暴露抗原决定族，利于抗原抗体反应；而罗氏细胞凋亡试剂盒说明书中应该也没有提及抗原修复吧？2. TUNEL检测细胞凋亡原理是用来测定DNA断裂的3‘-OH和TDT-dUTP结合，他们的结合反应不是抗原抗体反应原理，该方法的关键是如何使TDT-dUTP等试剂充分进入细胞核内进行反应，所以应该有细胞通透这一步骤，用蛋白酶K、Triton等均可。3.

1 回答864 围观

问实验中怎样染色才会达到最佳程度？

赵栋2012

初次做凋亡，一般按照试剂盒说明书做即可，但要附上阳性对照。根据结果进行对实验过程调整。我个人认为试验过程中tunel酶反应的时间、过氧化氢的灭活时间、DAB染色时间、苏木素复染时间、PBS浸洗时间等都可以通过上次试验结果进行微调从而使试验染色达到最佳。

1 回答743 围观

问荧光显像后用什么封片？

赵栋2012

一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可，若需长期保存，也可用无色指甲油片周围封固（必要性不大）。

1 回答1069 围观

问DNA 纯化为何只说硅胶膜吸附法？

我是金博士

方法一是硅胶膜吸附法，方法二是离子交换住法，而磁珠吸附法已经不怎么用了。方法一适合去除一些杂带等，方法二则能纯化得比较彻底。你可能只看到方法1，没看到方法2哦。一般都建议方法2的。

1 回答5254 围观

问是否罗氏的试剂盒并不需要后面的脱水、透明步骤？

tao0129

罗氏凋亡试剂盒有两种方案。1 一种荧光显微镜观察和一种DAB显色。因为他用的是荧光素标记的dUTP，若用荧光显微镜观察，那后面的酶标记抗荧光素抗体就不要孵育了，也不要脱蜡透明，只要用抗荧光催灭封片液封片即可。2 而后者还是需要进行POD-抗荧光素抗体孵育，最后还要进行脱蜡、透明和中性树胶封片。

1 回答1791 围观

问膜片钳是一个监测技术的概念，还是一个监测器械的概念？

962 围观

问在做PCR的引物设计时添加酶切位点应该考虑哪些问题？

我是金博士

1、移码：这是最重要的，一定要放到具体的质粒上去看，看看你加的酶切位点，连上你的目的基因，是不是会引起移码。2、酶切位点是否好切：尽量选实验室常用的，前提是你的基因片段不能有酶切位点序列，要不然就会连基因也切碎了。3、保护碱基：针对不同的酶切位点，选择不同的碱基。一般是3个，至于具体选CG还是AT就要看你的引物Tm以及碱基含量。

1 回答2025 围观

问苏木素复染后还用盐酸酒精分化吗？

tao0129

1.盐酸酒精分化的目的：一方面是分色；另一方面是减弱过强的苏木素核染色。所以你若把握好苏木素着色，也可不分化。2.分化时间不能过长，否则阳性着色也褪色。

1 回答3085 围观

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