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问
蛋白表达量低,并且多是包涵体形式,请问,如果做EMSA,该怎么办呢?
bylvjing
我们最近也在做这个,做了一个月,各种优化原核表达的条件,还是多数以包涵体的形式存在。处理方法:1、换载体,我们用的标记基因蛋白可能大了,把GST换成了His,不知道结果怎样。2、用Thermo的试剂盒,它能把包涵体中的蛋白复性,但是价格也不便宜3、技术指导说可以用上清直接和探针结合,毕竟还是有上清还是有少量可溶性蛋白的。不知道对你有没有帮助,你可以试试
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问
请教免疫组化染色的问题
ykq08
我以前做HE染色的时候,如果染色过深的话会在75%酒精里面浸几秒钟,然后颜色就变浅了,你的会不会是因为酒精脱水造成的呢,仅供参考
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问
求问红细胞凋亡实验原理和步骤?
我是金博士
这里有一篇比较老的文献,供你参考,另外万方和维普中有很多相关研究的。http://www.biomart.cn/experiment/430/488/498/33578.htm
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问
微波修复时是否该阻断?
赵栋2012
1. 微波修复的目的是什么?在免疫组化中是用来抗原修复,暴露抗原决定族,利于抗原抗体反应;而罗氏细胞凋亡试剂盒说明书中应该也没有提及抗原修复吧?2. TUNEL检测细胞凋亡原理是用来测定DNA断裂的3‘-OH和TDT-dUTP结合,他们的结合反应不是抗原抗体反应原理,该方法的关键是如何使TDT-dUTP等试剂充分进入细胞核内进行反应,所以应该有细胞通透这一步骤,用蛋白酶K、Triton等均可。3.
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问
实验中怎样染色才会达到最佳程度?
赵栋2012
初次做凋亡,一般按照试剂盒说明书做即可,但要附上阳性对照。根据结果进行对实验过程调整。我个人认为试验过程中tunel酶反应的时间、过氧化氢的灭活时间、DAB染色时间、苏木素复染时间、PBS浸洗时间等都可以通过上次试验结果进行微调从而使试验染色达到最佳。
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问
荧光显像后用什么封片?
赵栋2012
一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可,若需长期保存,也可用无色指甲油片周围封固(必要性不大)。
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问
mirna206RT-PCR 引物和内参有什么资料可参考学习?
我是金博士
请你明确问题,是miRNA RT-PCR还是miRNA real time PCR?
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问
肝细胞膜蛋白的免疫组化需要注意点什么呀?
gynju
免疫组化关键还是抗原的修复和一抗是否好用,曾经做出来过应该是没有问题的。DAB显色是需要在显微镜下观察的,有的时候非常快的,几十秒都可能出来,建议可以每次多做一张片子,把它放在显微镜下调好焦距然后再滴加DAB,同时记录时间,然后按时间做其它的片子。
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问
蛋白诱导表达量低,并且检测不出活性是怎么回事?
我是金博士
这个问题很常见,能表达出蛋白不容易,表达出的蛋白有活性也不容易。不过不用太着急,可以试着从这几个方面着手: 1、首先要确定是否有目的蛋白条带,是否落在理论大小处。这个可以通过SDS-PAGE来观察。2、如果表达量低,建议优化表达条件,比如改变温度,诱导剂浓度等。然后将蛋白纯化后再测酶活。3、没有活性还有一个可能是你的活性检测方法不对,这个需要你结合实验室基础或者文献来修缮,没有固定的方法。
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问
DNA 纯化为何只说硅胶膜吸附法?
我是金博士
方法一是硅胶膜吸附法,方法二是离子交换住法,而磁珠吸附法已经不怎么用了。方法一适合去除一些杂带等,方法二则能纯化得比较彻底。你可能只看到方法1,没看到方法2哦。一般都建议方法2的。
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问
是否罗氏的试剂盒并不需要后面的脱水、透明步骤?
tao0129
罗氏凋亡试剂盒有两种方案。1 一种荧光显微镜观察和一种DAB显色。因为他用的是荧光素标记的dUTP,若用荧光显微镜观察,那后面的酶标记抗荧光素抗体就不要孵育了,也不要脱蜡透明,只要用抗荧光催灭封片液封片即可。2 而后者还是需要进行POD-抗荧光素抗体孵育,最后还要进行脱蜡、透明和中性树胶封片。
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问
Elisa 标本重复冻融使用会影响结果吗?
我是金博士
一般来说,标本拿出后再放回去次日做,效果肯定会有点影响,至于降解应该没那么快。但你标本为啥不分装呢?每次用一支或一管。用完就不要了,就没有这个问题了呀。
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问
肿瘤细胞诱导血管生成模型,有相关中外文文献么?
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问
膜片钳是一个监测技术的概念,还是一个监测器械的概念?
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问
流式细胞仪标本的制备的具体步骤是什么?
我是金博士
1.收集细胞。上皮细胞需要蛋白酶消化,然后收集。加PBS或者流式洗液 1ml ,振荡,1400rpm 离心5min ,弃上清。2.染表型悬浮细胞于100ul体积,细胞浓度约为或者小于 1X10^6,加入流式染色抗体。按照说明书用量或者减半(根据经验)。分出一管作为同型3. 4度 ,避光30min, 用PBS 洗一遍,1400rpm 离心5min ,弃上清。4. 破膜破膜剂 以BD pharming
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问
双酶切后的DNA去磷酸化处理时应该在酶切同时进行还是酶切后再进行去磷酸化处理?
我是金博士
在酶切后的,反应体系不一样的呢。
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问
巢式PCR筛查某种病毒 两次结果不一致,该怎么办?
我是金博士
重复性不好,就说明实验失败了。重复地出来才行。PCR能出现问题的地方太多了,你感觉你都注意到了,可能有些地方是错觉。我的建议是,看看做成功的人是怎么操作的,这个主要是用来检查你个人的操作习惯。另外,做好对照,一步步排查。引物啊,模板啊,PCR条件等都会有影响。
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问
细胞免疫荧光步骤需要注意的问题?
我是金博士
具体步骤是:1、细胞爬片2、4%多聚甲醛固定10 min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)3、PBS漂洗5 min4、0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)5、PBS漂洗2次,每次5 min6、1%BSA封闭30 min7、加入1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2 h8、PBS漂洗2次,每次5 min9、加入1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1 h10、PBS漂
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问
在做PCR的引物设计时添加酶切位点应该考虑哪些问题?
我是金博士
1、移码:这是最重要的,一定要放到具体的质粒上去看,看看你加的酶切位点,连上你的目的基因,是不是会引起移码。2、酶切位点是否好切:尽量选实验室常用的,前提是你的基因片段不能有酶切位点序列,要不然就会连基因也切碎了。3、保护碱基:针对不同的酶切位点,选择不同的碱基。一般是3个,至于具体选CG还是AT就要看你的引物Tm以及碱基含量。
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问
苏木素复染后还用盐酸酒精分化吗?
tao0129
1.盐酸酒精分化的目的:一方面是分色;另一方面是减弱过强的苏木素核染色。所以你若把握好苏木素着色,也可不分化。2.分化时间不能过长,否则阳性着色也褪色。
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